三种重组肝素酶的表达条件优化及分离纯化.pdf

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1、论文评阅人1：评阅人2：评阅人3：评阅人4：评阅人5：答辩委员会主席：委员1：委员2：委员3：委员4：委员5：⑧登：盘鳓塑越盗!塑I盗左喹!塑名签者师作教文导论指IIIIIlllIJl／rlllllllJIIllMHIIIIIIIIIY2374302』、J●●·●-1h●一‘n’一————UDtlm屹atlonandrUnticationotthreerecombinantAuthor’Ssignature：一■Supervisor’Ssignature：Thesisreviewer1：Thesisreviewer

2、2：Thesisreviewer3：Thesisreviewer4．Thesisreviewer5：Chair：．山—吣(Committeeoforaldefence)Committeeman2：Committeeman3：Committeeman4．Committeeman5：Dateoforaldefence：浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝

3、姿太鲎或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：f毗签字日期．弘f游6月厂日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝婆盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝婆盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：i瞒签字日期：弘历年6月歹日导师

4、签名：厂≥7砂乙f∥签字日期：弘伍年<月浙江大学硕士学位论文致谢本课题的研究工作是在徐志南、蔡谨和黄磊老师的严格要求和细心指导下完成的。首先感谢徐志南教授为我们营造了良好的学术氛围和科研环境。徐老师开拓创新的学者风范、博大的胸怀和诚恳的为人、磊落的品质、渊博的学识、严谨的治学风范和达观进取的人生态度值得我终生学习。在此，学生向您表示最诚挚、最衷心的感谢。由衷地感谢我的导师蔡谨老师，蔡老师深厚的理论基础、活跃的思维、对科研工作的执着追求给我留下了深刻的印象，使我受益匪浅。三年的研究生生涯虽然短暂，但老师对我的教诲对我

5、的一生都将产生重要的影响。感谢课题组指导老师黄磊老师给予我的帮助和鼓励。感谢三年以来与我互勉共励的课题组全体成员，特别感谢博士生盛嘉元、郑强、祝琳琪、张绪、张慧莉、施周铭、朱凡、李晓燕、赵伟军、濮悦、唐云平、王海蛟等；硕士生张丹萍、陈旭、潘剑锋、于怡，刘云平、王金、郑书香、宗超等人的热情帮助，在此一并表示感谢。他们对本文的工作提供了不少参考性意见，为研究工作的如期完成提供了重要帮助。还有许多帮助过我的同学没有一一列出，在此一并表示感谢。本工作是国家科技研究与发展项目(NO．2011AA02A114)的部分内容。本人

6、能顺利完成学业，与父母、亲人的关心、帮助和激励是分不开的，在此谨向父母、亲人表示衷心的感谢和深深的敬意。她们不仅在学业上，还在生活上给予了我许多帮助。谨向所有关心和帮助过本人的老师、同学、朋友和亲人再次表示衷心的感谢!任永海二零一二年五月于求是园浙江大学硕士学位论文摘要本文在大肠杆菌中重组表达三种肝素酶，在摇瓶中通过表达条件优化提高目标蛋白的可溶表达量，进一步于5L发酵罐中扩大培养，在此基础上利用Ni离子亲和层析纯化蛋白，最后对蛋白的活性进行了测定。首先，优化肝素酶I在大肠杆菌EcoliBL21(DE3)／pOFX

7、．T7．SLl中的重组表达条件，结果显示在MBL培养基中，接种6h(OD600≈2．5)后加入0．25raMIPTG，在25。C下表达8h目标蛋白酶活达到最高值1．49×105IU／L。进一步于5L发酵罐中扩大培养，20h后最高酶活达到5．55×105IU／L。利用亲和层析分离目标蛋白，肝素酶I的纯度可达到96％，回收率为37．58％，比酶活达到1．12×103IU／mg。其次，优化肝素酶II在大肠杆菌EcoliBL21(DE3)中的重组表达条件，结果显示在MBL培养基中，在对数生长期初期(OD600≈2．5)后加

8、入0．5raMIPTG，在25。C下表达6h目标蛋白酶活达到最高值8．70×103IU／L。进一步于5L发酵罐中扩大培养，18h后最高酶活达到2．35×104IU／L。利用亲和层析分离目标蛋白，肝素酶II的纯度可达到90％，回收率为47％，比酶活达到196IU／mg。最后，优化肝素酶III在大肠杆菌EcoliBL21(DE3)中的重组表达条件，结果显示在MB