对鞘翅目昆虫高毒力苏云金芽孢杆菌的筛选鉴定.pdf

《对鞘翅目昆虫高毒力苏云金芽孢杆菌的筛选鉴定.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、中文：摘要中文摘要鞘翅目害虫是目前影响农作物和林木产量、品质的重要靶标昆虫类别，在世界广泛分布，由于其具有钻蛀性、土壤栖居性和迁飞性很难有效防治，当前主要防治策略是以化学农药为主、生物防治为辅。化学农药的长期施用对害虫天敌以及有益昆虫也具有毒杀作用，极易打乱生态平衡，而且高残留性也造成环境污染，因而生物农药以其靶向性强、对环境无污染、对人畜安全等优点逐渐被人们重视。目前，相关学者对应用苏云金芽孢杆菌防治鞘翅目害虫的研究日益重视，已经成为国内外研究的热点方向之一。本试验从全国采集的土样中，分离Bt菌株，通过室内测定生物活性筛选出对鞘翅目害虫具有高毒力的菌株；

2、摸索毒力最高的Bt菌株B．HLJ一37最佳发酵条件及最优发酵培养基组分；克隆、表达高效杀虫基因。结果如下：1．使用温度筛选法从100份±样中分离出47株野生型Bt菌株，利用典型鞘翅目害虫黄粉虫作为靶标昆虫进行室内生物活性测定，有8株菌对黄粉虫死亡率达到70％以上。毒力测试结果显示，菌株B．HLJ一37毒力最强，对黄粉虫48hLCso为382．02mg／L，对榆蓝叶甲48hLC50为507．43mg／L。对杀虫效果较好的8株菌进行形态学、生理生化及cry基因型鉴定，初步判断B．HLJ一37为山东亚种，含有cry8Ea类基因；B．SD．26为山东亚种，含有cr

3、y8Aa类基因；B．HLJ．66为励木亚种，含有cry8Ba类基因；B．AH一6为励木亚种，同时含有crylAb类和cry8Ea类基因；B。HLJ．60为云南亚种，含有cry8Ba类基因：B．见．3为武汉亚种，同时含有cry3Aa和cryllbl类基因；B．AH．2为以色列亚种，同时含有crylAc类和cry8Bb类基因；而B．HLJ．47与已公布的各亚种生理生化指标各不相同，还需结合其他方法进一步确定其亚种类型，含有cry3Aa类基因。2．对毒力最高的Bt菌株B．nLJ．37进行一系列单因素摇瓶发酵实验，摇瓶环境下最佳发酵条件为：使用种子液龄期为10h；

4、种子液接种量为2％；摇床转速为200r／min；发酵温度为30"C；培养基初始pH值设置在7~7．5之间：发酵时间为IlllllllllllIlnlllllllllllllllllllllY2122365黑龙江大学硕士学位论文48h。使用优化后的参数进行摇瓶发酵，可测得活芽孢数达到9．05x108CFU／mL，活菌数达到3．01x109CFU肺L，晶体蛋白含量为20mg／mL。设计正交试验(7因素3水平)以确定菌株B．HLJ．37的发酵培养基最优组分：葡萄糖0．305、玉米粉1．505、豆饼粉2％、鱼粉1．o％、酵母粉1．5％、K2HP040．205、Ca

5、Cl20．305。3．成功克隆出了cry8Ea基因。测序结果表明该基因由3481个碱基组成，基因编码的蛋白质由1161个氨基酸构成。分析其编码蛋白质的理化性质：分子式为C5862Hgol2N157401835$24，分子量为131666．9，等电点为5．03，为弱酸性蛋白。cry8Ea蛋白二级结构主要由Q．螺旋和无规则卷曲交错构成。将cry8Ea插入pET-28a后构建重组表达载体pET28a—cry8Ea，将其转化到BL21中。诱导表达后，经SDS-PAGE分析，在大肠杆菌BL21中表达出130kD大小的蛋白，将目的蛋白纯化后，经过杀虫活性验证，cry8

6、Ea的蛋白表达产物对黄粉虫没有杀虫活性；对榆蓝叶甲具有较高的毒力，其LC50达501．28mg／L。关键阑：鞘翅目、苏云金芽孢杆菌、cry、杀虫活性AbstractColeopterawithwidelydistributionwasthekeyinsectfactorthatinfluencedtheproductionofcropsandwoods．Becauseoftheirdrilling，soild-dwellingandmigratory,theyweredifficulttobecontroleffectively．Currentcontro

7、lstrategiesweremainlybasedonchemicalpesticideswithbiologicalcontr01．Long-termuseofchemicalpesticidesmadebadinfluenceonnaturalenemiesofpestsandotherbeneficialinsectsandcouldupsettheecologicalbalanceandcausetheenvironmentpollution．Becauseofitssafety,environment—friendlyandgoodtarget

8、ing，thebiologicalcontrolwaspaidmo