人源TRIM2和结核分枝杆菌TreS的表达纯化和晶体生长.pdf

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1、UniversityofScienceandTechnologyofChinaAdissertationformaster’Sdegree■●一■■■●■一■IneeXpressIOn。pUrJtJCatIOnandcrystalizationofhumanTRIM2andMycobacteriumTuberculosisTreSAuthor’SName：Speciality：Supervisor：1⋯o●otmmhedtime：XingruLvBiochemistryandMolecularBiologyProf．ZiheRaoSeptemb

2、er30也，2012lIIIIIIIIIIIIIIIIlY2254620中国科学技术大学学位论文原创性声明本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：吕墨垒签字日期：加阪小S中国科学技术大学学位论文授权使用声明作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允

3、许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入《中国学位论文全文数据库》等有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。日公开口保密(——年)作者签名：昌墨苤里2一“i一牵一，吾一7篮∥一名期签日师字导签摘要TRIM(TripartiteMotif)蛋白家族(或者称为RBCC家族)是一类含有RING(R)、B．box以及Coiled．Coil区的多结构域蛋白，它不仅参与细胞生长、发育，并与各种人类疾病(癌症、遗传病)以及抗病毒感染等密切相关。

4、TRIM家族蛋白内部结构元件的排列顺序(R．B．CC．Cterm)的一致性揭示了它是通过整体结构行使功能-oTRIM2蛋白由RING、B．box、Coiled．coil区和NHL四个结构域组成，在神经系统中高度表达并与神经元活动密切相关。TRIM2的N端的RING结构域具有泛素连接酶的活性，通过结合并泛素化神经纤维轻亚基(NF．L)来调节其代谢。其C端的NHL结构域参与了与非常规动力蛋白myosinV的相互作用。TRIM2的错义突变或者功能缺失将导致NF．L在轴突的堆积，形成神经组织的肿胀，进而引起神经退行性病变。本文主要对TRIM2的全长及各

5、个截短片段进行了克隆构建和蛋白的纯化，并进行晶体的生长尝试，获得了其中的截短体(320．744aa)酶解后的晶体和初步的衍射数据。本文为人源蛋白TRIM2的结构的研究奠定基础，对于进一步揭示该蛋白参与和行使功能的分子机理的信息具有重要意义。由结核分枝杆菌(Mycobacteriummbemulosis)引起的结核病是目前世界上致死率最高、传播范围最广的细菌性疾病之一。海藻糖合成酶(TrehaloseSynthase，TreS)是催化海藻糖合成通路中的酶，在结核杆菌中主要功能是催化麦芽糖和海藻糖之间的相互转化，同时还可以将糖原转化成为海藻糖。最新

6、研究表明TreS还可以催化海藻糖向旺．葡聚糖的转化，这个通路称为结核杆菌的自我毒性通路。为了深入了解结核分枝杆菌中TreS蛋白发挥功能的分子机制，我们采用大肠杆菌表达系统，表达和纯化了TreS重组蛋白。通过Thermofluor实验筛选到有利于蛋白稳定的缓冲液。由于TreS蛋白在纯化过程中聚集状态不均一，我们设计了五个突变体E280A、C251S、C595S、C251S／C595S、C251S／C595S／E280A，表达和纯化获得了较高纯度的突变体蛋白。对重组蛋白和突变体进行结晶尝试后，得到了突变体C25lS／C595S的晶体，为TreS蛋白

7、的三维结构的解析，并进而揭示TreS发挥酶活作用的分子机制奠定基础。关键词：人源TRIM2泛素连接酶NHL结构域结核分枝杆菌海藻糖合酶晶体生长AbstractABSTRACTTheTripartitemotif(TRIM)familycontainsthreetypesofdomains，aRING(R)，B-box，followedbyaCoiled—Coilregion．Thefamilyhasalotofmemberswhicharefunctioningdifferentlysuchasparticipatingincalldevelo

8、pment,growthandhumandiseasesincludingcancerandhereditarydiseases，andantivim