下游技术实验讲义.doc

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1、【实验一】薄层层析分析果汁糖成分/【目的要求】学习、掌握薄层层析分离的基本操作技术。【实验原理】薄层层析是一种微量而快速的层析方法。最早是Izmailov和Schraiber在1938年采用氧化铝薄层分离了植物提取液。层析是在吸附剂或支持剂均匀涂布的薄层上进行的，故称薄层层析。为了使所要分析的样品各组分得到分离，必须选择合适的吸附剂。硅胶、氧化铝和聚酰胺是广泛采用的吸附剂，硅藻土和纤维素是分配层析中最常用的支持剂，在吸附刘或支持剂中添加了适合的粘合剂再涂布，可使薄层粘牢在玻璃板（或涤纶片基）这类基底上。硅胶G是一种添加了粘合

2、剂的硅胶粉，约含12%-13%的石膏（CaSO4）,它可以把一些物质从溶液中吸附于自身的表面上，利用它对各种物质的吸附能力不同，再用适当的溶剂系统展层使不同的物质得以分离。例如糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的分子量和轻基数有关，经过适当的溶剂展开后，糖在薄板上的移动速度是戊糖〉己糖〉双糖〉三糖。若用硼酸溶液市制硅胶G可改进分离效果。对己分开的斑点显色，而将与它位置相当的另一个未显色的斑点从薄层上与硅胶G—起刮下，以适当的溶剂将糖从硅胶G上洗脱下来，就可用糖的定量测定方法各组分的含糖量。薄层层析一般采用上行法，在具有密闭盖子的

3、玻璃缸中进行，溶剂倒于缸底，简单地将薄板放入即可。保证戻析缸内有饱和的蒸气是实验成功的关键。保证措施是在层析缸内壁衬一层浸湿溶剂的滤纸或缩小层析缸的容积。因为层析时，溶剂会从薄层上蒸发，样品移动到一定距离的时间就会处长。若所用溶剂系统由儿个成分组成，挥发性较大的成分首先蒸发,就会使混合溶剂的组分改变，而溶剂的蒸发从薄板的中央向两边递减，致使溶剂前沿呈弯曲状，结果往往是使两边的Rf值大于中央位置的Rf值。薄层层析与其它方法比有明显的优点：层析时间短，可以分离多种化合物，用样品量少（微克级），与纸层析相比要灵敏10J00倍，观察

4、结果方便，显色方法甚至可以用腐蚀性显色剂。【实验用品】1•器材：层析柱，铁架台及蝴蝶夹，部分收集器，恒流泵，喷雾器，层析缸，恒温烘箱，电吹风，毛细玻璃管，离心机，离心管，研钵，玻璃板等2.药品试剂：硅胶G,果汁（自制），1%标糖溶液（葡萄糖、果糖、蔗糖、鼠李糖、棉籽糖、木糖等）、混合糖溶液、显色剂（苯胺、二苯胺、丙酮、磷酸），展开剂（正丁醇：乙酸乙酯:异丙醇：冰乙酸：水=2：6：6：4：1）【实验过程】1、制备硅胶G薄层板取硅胶G粉3.0g研钵中，加9mL0.5%的竣甲基纤维素钠水溶液，调匀后铺于洁净平整的玻板上，铺层后自然

5、风干、固结，再于105°C烘箱中烘干活化lh。取出后可用，亦可贮于干燥器中备用。薄层表面要求平整，厚薄均匀。2、糖在硅胶G薄层上的分离选制备好的薄板一块，在距底边1.5〜2cm的位置用铅笔轻画直线，选6个点，相互等距（大于lcm）。用毛细管分别点上不同的糖样品（点1~2次即可），斑点直径不超过3mm。待薄层上样品自然干燥后，将薄板置于盛有层析溶剂的层析缸中，自下向上展层，当展层溶剂到达离薄板项端约lcm处时取出薄板，前沿作一记号，吹干，除尽溶剂后均匀地喷上苯胺•二苯胺显色剂，100°C烘烤5T0min。3、观察记录。绘图，并

6、记录各斑点的位置、颜色，测量色斑中心至起点以及展开剂前沿至起点的距离,计算Rf值。根据样斑的大小形状、颜色及深浅和Rf值分析果汁中的糖分。【注意事项】1-调制硅胶G成糊状物，稀稠合适，铺板迅速，均匀，表面平整。特别是点样端，耍铺满玻板。2.点样时，样斑直径控制在3mm以内，样斑间距至少lcm;3.展开时，样品不能浸到展开集中；4.显色剂中的苯胺有毒，使用时应在通风柜中，避免与皮肤接触。【实验二】牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备【目的要求】学习、掌握盐析法、等电点沉析分离的基本操作技术。【实验原理】乳蛋白素广泛存在于乳品中，是

7、乳糖合成所需耍的重耍蛋白质。牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，酪蛋白在pH为4.8左右会沉淀析出，但乳蛋白素在pH3左右才会沉淀。利用此性质，可现将加热至40C的牛奶中加硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来，酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中除去脂类杂质。将除掉酪蛋白的滤液pH调至3左右，能使乳蛋片素沉淀析出，部分杂质可随澄清液除去。再经过一次pH沉淀后，即可得粗粗乳素蛋白素。蛋白质、酶、氨基酸、核酸等都是两性电解质，当其溶液在某一pH值时，这些生物大分子的所带的止负电荷数目相等而呈电中性，此时溶液的pHffi称为该物质的等电

8、点。生物大分子在其等电点的溶液中，溶解度最低，易发生沉淀，一般疏水性较强的蛋白质可用此法分离。【实验用品】1＞器材：烧杯（100mL、250mL）＞玻璃棒、滴管、量筒、低速离心机、50ml离心管、水浴锅、真空泵、布氏漏斗、抽滤瓶、精密pH试纸、酸度计、表面皿、电子天平等；2、试剂：脱脂鲜牛