生物工程下游技术实验

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1、生物工程下游技术实验实验讲义实验一酵母RNA的提取及含量测定（紫外吸收法）（院新大楼336实验室）实验二管式离心机、厢式压滤机、陶瓷微滤膜及超滤、纳滤、反渗透膜实际操作与原理（生物园、兰花中心）实验三黑曲霉β-D甘露聚糖酶的纯化、盐析实验四盐析β-D甘露聚糖酶活力测定（院新大楼336实验室）实验一酵母RNA的提取及含量测定一、实验目的与要求1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。2、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法，3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。二、实验原理由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实

2、验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后,上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA

3、含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm波长的紫外光。核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm处。遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm波长处

4、的消光值（即光密度，或称为光吸收）。核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH和离子强度发生变化。RNA溶液（pH=7.0）的ε（ρ）=7700-7800，RNA的含磷量为9.5%，含1μg/mLRNA溶液的光密度为0.022-0.024。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可计算测出其中核酸的含量。该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3μg/mL的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小。蛋白质由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm波长处的吸收值

5、仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中的蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。三、主要仪器和试剂啤酒酵母粉0.04MNaOH溶液95%乙醇、乙醚、酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mLHCl。紫外分光光度计离心机真空干燥箱三角瓶、烧杯水浴锅四、实验步骤1、称5g干酵母粉悬浮于30mL0.04MNaOH溶液中，并在研钵中研磨均匀。2、悬浮液转入三角烧瓶，沸水浴加热30min，冷却，转入离心管，3000转/分，离心15分钟后，将上清慢慢倾入10mL酸性乙醇，边加边搅动。3、加毕，静置，待RNA沉淀完全后，3000r/min离心3min。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次。4、再用乙醚洗涤沉

6、淀一次后，用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量，5、纯度测定：将样品配制成含5～50μg核酸/mL的溶液，于紫外分光光度计上测定260nm和280nm吸收值，计算核酸浓度和两者吸收比值。五、计算：O.D260为260nm波长处的光密度读数；L为比色杯的厚度，一般为1或0.5；0.024为1μgRNA/mL的光密度；0.020为1μgDNA/mL的光密度六、思考题1.破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行?2.为什么用酵母作为实验原料？如何使RNA从酵母中释放出来？RNA的等电点是多少？3为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？4.核酸的溶解性质是什么?常用什么试

7、剂分离沉淀核酸?实验二管式离心机、厢式压滤机、陶瓷微滤膜及超滤、纳滤、反渗透膜实际操作与原理一、管式离心机（GF-105型）1．实验目的弄懂管式离心机的结构和操作原理2．基本原理待处理发酵悬浮液在一定压力下由进料管经底部空心轴的喷嘴进入转鼓，靠挡板分布于鼓的四周，悬浮液在鼓内由挡板被加速到转鼓速度（21000rpm），因受惯性离心力的作用被甩往鼓壁，但由于悬浮液中的颗粒和菌体（重相）具有比轻液（水）较大的密度