犬瘟热病毒(CDV3株)拯救系统初步构建.pdf

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1、万方数据InitialConstructionofCanineDistemperVirus(CDV3Strain)RescueSystemT1‘submittedt011eSlSSUmlttctoldaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAqronomy1一一DuXiang(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor:ProfessorShanHuSupervisor:AssociateP

2、rofessorJiangWenmingQingdao.ChinaJune,2014万方数据本研究受科技部863计划《重组疫苗和干扰素动物生物反应器创制》与农业部2012年科技基础性工作专项《畜禽重要疫病流行病学调查》资助万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生繇奄善酮时间

3、:矽/0年6月工占日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名:导师签名:私酮时间:"fq年6月2舌日时间:,,,≮年‘月j‘日万方数据青岛农业大学硕:t学位论文摘要犬瘟热病毒(CDV3)株拯救系统初步构建摘要为了建立犬瘟热病毒反向遗传操作系统以研究犬瘟热病原,使用犬瘟热CDV3株应用RT-P

4、CR方法分多个片段扩增得到犬瘟热病毒全基因,将基因连接到T载体中进行测序,测序正确片段进行链接构建犬瘟热病毒全基因链接的中间质粒,将中间质粒分别酶切后依次插入经过改造多克隆位点的pⅥ议l载体,;0pVAX—rCDV;以pvAX托DV为模i反PCR扩增N、P和L基因,双酶切后插入pⅥⅨ1,pVAX—N、pVAX-P和pVAX—L;为建立一种鉴定辅助质粒表达犬瘟热病毒RNA聚合酶活性的方法,通过PCR方法扩增犬瘟热病毒cDNA的Leader和Trailer序列,通过PCRZAplRES2.EGFP中扩增EGFP基因,三段基因片段通过两次连接PCR桥接,双酶切后反插A.

5、pCl-neo载体中,构建了犬瘟热病毒微基因组。结果表明,犬瘟热病毒在基因长度和序列上都保持了较为稳定的遗传特性,测序检测到的23处突变对病毒的各特性无明显影响:pVAXl载体多克隆位点替换后测序正确;pVAX.rCDV&基因经过验证与病毒序列一致:辅助质粒目的基因插入位置和阅读框正确:犬瘟热病毒微基因组序列构建完成。本试验为犬瘟热病毒反向遗传系统建立和相关机制研究奠定了基础。关键词:犬瘟热病毒:反向遗传:病毒微基因组万方数据青岛农业大学硕士学位论文AbstractInitialConstructionofCanineDistemperVirus(CDV3Stra

6、in)RescueSystemAbstractInordertoestablishvirusrescuesystemtostudyCanineDistemperpathogenicagenLthegenomeofcaninedistemperviruswasamplifiedfromCDV3strainbyRT-PCRintoseveralfragments.Eachfragment,whichlinkedintoT—vector,sequencedcorrectly,Wasusedtoconstructintermediateplasmid,afterdoubl

7、erestrictedendonucleasedigestingeachintermediateplasmidandpVAX1vectorwhichmultiplecloningsitehasbeenreplaced.InsertingthethreefragmentswhichcutofffromintermediateplasmidintopVAX1inturntobuildpVAX·rCDV;InsertingN,PandLgenewhichacquiredfrompVAX·rCDVbyPeRintopost-digestedpVAXltoconstruct

8、assis

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