犬瘟热病毒分离毒SD16F株拯救系统的构建

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1、分类号密级UDC单位代码10435硕士学位论文犬瘟热病毒分离毒SD16F株拯救系统的构建ConstructionofaRescueSystemforSD16FIsolateofCanineDistemperVirus研究生姓名：吴佳琦指导教师：黄娟副教授单虎教授学科专业：预防兽医学研究方向：动物传染病防治与生物制品学中国·青岛二0一八年六月ConstructionofaRescueSystemforSD16FIsolateofCanineDistemperVirusThesissubmittedtoQingdaoAgricultu

2、ralUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyWuJiaqi（CollegeofVeterinaryMedicine)Supervisor:AssociateProf.HuangJuanProf.ShanHuQingdao.ChinaJune,2018独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获

3、得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日青岛农业大学硕士学位论

4、文摘要犬瘟热病毒分离毒SD16F株拯救系统的构建摘要犬瘟热（Caninedistemper,CD)是由犬瘟热病毒（Caninedistempervirus,CDV)引起的犬科和其它肉食动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病已在全世界流行，随着病毒的进化，由传统的仅感染犬科动物，逐步威胁到野生肉食动物。反向遗传操作技术（Reversegenetics)是分子病毒学研究领域的一种新型技术，是指通过构建RNA病毒感染性克隆达到模拟真实病毒粒子，进入细胞复制以及传代从而得到具有真实感染性的病毒颗粒的过程。本试验主要研究以下内容。1.

5、为了研究犬瘟热病毒野毒株在Vero-SLAM细胞上连续传代培养后的基因变异情况，将本实验室保存的一株已知全基因组序列的犬瘟热野毒Hebei株在Vero-SLAM细胞上连续传12代，选择TaKaRaExTaq酶进行RT-PCR，扩增覆盖其全长基因组的10个末端重叠的片段，获得Hebei株全长基因组序列，分析Hebei株在传代到12代后与初始序列的差异。结果表明Hebei株传代后较初始全基因序列有24处碱基突变，14处氨基酸突变。造成这种突变的原因可能是TakaraExTaq酶非高保真酶，PCR过程中有一定的突变率；PCR产物克隆到T

6、载体导致测序失真；犬瘟热病毒强毒株经Vero-SLAM细胞多次传代培养后发生基因变异。2.为了避免细胞传代及克隆测序的影响，本试验对CDVSD16F株分离株的第5代细胞毒，设计覆盖其全长基因组的多个末端重叠的引物，用TaKaRa公司的高保真酶TksGflexDNAPolymerase扩增，对扩增出的各段基因片段直接测序并使用MegAlign进行拼接。结果表明，成功获得SD16F株的全长基因组序列，与GenBank登录的21株CDV参考毒株的全基因核苷酸序列同源性为91.9%-99.5%，其中，亲缘性最近的是SD(14)7株，同源性

7、为99.5%，与国内疫苗株CDV3同源性为92.1%，与Onderstepoort株亲缘关系最远，同源性为91.9%。进化树分析显示SD16F株属于AsiaI型。全长基因组序列的获得为接下来构建SD16F株全长感染性cDNA克隆奠定基础。®3.为了构建SD16F株全长cDNA克隆，本试验采用In-FusionHDCloningKit无缝连接技术分三步克隆，第一步是3’端克隆，将丁型肝炎病毒核酶（HdvRz)全部序列添加到引物中，根据NheI和NotI限制性酶切位点克隆到pCI载体上，命名为pCI-CDV-3’；第二步扩增出中间序列

8、以SphI酶切位点插入到pCI-CDV-3’质粒中，命名为pCI-CDV-3’-Plus，第三步克隆是5’端克隆，将锤头核酶（HamRz)全部序列添加到引物青岛农业大学硕士学位论文摘要中去，以SphI酶切位点插入到pCI-CDV-3’-Plus，重