PCR在HIV感染研究中的应用.doc

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1、PCR在HIV感染研究中的应用•H1!ri简介HIV与PCR技术•主体内容一、HIV的基因结构二、PCR在鉴定HIV感染中的童义三、HIV感染的定量PCR研究四、PCR的相关问题五、实例•结语•前言八I•年代以来山人类免疫缺陷病毒HIV(HumanImmunodeficiencyVirus)感染而引起的艾滋病(AIDS)I大1其严亜的危害性而受到人们高度巫视。HIV图二：HIV力争N期诊断和寻求仃效治疗是防止其广泛传播的关键所在。聚合酶链式反丿''、,(polymerasechainreaction,PGR)1985年，Mallis等根据

2、核酸H然扩增理论，建立了一种人工体外DNA扩增技术，即聚合酶链式反应，并于1987年完成了自动化操作，极大地推动了分子生物学的发展，也为包括病再感染在内的临床疾病诊断提供了一种崭新的于-段。1、PCR的基本原理靶DNA分子变性后解链，两条单链DNA分别经复性与两条引物互补结合,在4种dNTP存在和合适的条件下，山DNA聚合酶催化引物山5'—>3'扩增延长，每经过变性、复性、延伸一个循环，模板DNA增加1倍，新合成的DNA链乂可作为下一个循环的模板，经过30〜50个循环，可使原DNA量增加106-109倍。2、主要步骤PCR的每一循环包括变

3、性、复性、延伸3个步骤，此外整个试验应包括DNA模板提取，如果模板为RNA,还需增加从RNA到DNA的逆转录过程。除模板提取外，这些操作均可在同一系统中完成，仅仅改变反应温度即可完成。3、引物的设计4、常用的PCR技术（定量PCR等）5、PCR产物的分析（凝胶电泳等方法）PCR具冇敏感、特异和快速的特点，是检测艾滋病病毒、评价病情进展和探讨发病机理的有效工具。本文将就日前HIV与PCR研究的现状，谈谈PCR技术在HIV研究中的应用。一、HIV的基因结构HIV的基因结构与其它逆转录病毒基本相同，为RNA双分（，其单链RNA分了山9749个核

4、廿酸组成，有3组共9个基因。第一纽为逆转录病毒共同的基因：gag、pol、envffi因，及侧現的长末端亜复顺序（LTR）等。第二纽.为调节基因表达的基因：tat、rev、nef。第三组为特冇基因：vif、vpu、vprrrvCoreproteinsiralcnzymeiiLTRGAGENVInvclopcprotein%ENVHIVYrI-分高的遗传变异率，是一个多态性病痔。高度变异区在envffiw内，相当于gp120的五个区段，gag和pol基因较少变异。目前已知HIV彳j两个型：HIV,和HIV-2O因此,只有选择病毒基因组中高

5、度保守区域作为目的基因加以扩增,才能有效地检测所有HIV的变异性。二、PCR在鉴定HIV感染中的意义HIV常可引起潜伏感染，但仍具冇传染性，整介的病零基因组在侮个细胞中仅以很低的DNA拷贝数存在，因此，需要建立一个敏感而乂特异的HIV检测方法。传统的HIV检测方法•病毒体外培养法•逆转录酶法•外周血液中核衣壳抗原宜接检测法•原位杂交法•Southern印迹法等等缺点：比较费时费力，稳定性、特界性、敏感性较低。PCR方法的优点:三、HIV感染的定量PCR研究对体内的病毒水平作准确的定量分析，冇助于对感染过程的齐期作病因性分析，观察药物的疗效

6、，更好地指导治疗。目前检测体内HIV活性的方法仃限，虽然循环血CD4+细胞计数、血清P24抗原、新喋吩筹曾川来指示HIV感染时病毒的水平，其敏感性和特异性均受限，定量培养乂费时昂贵。定量PCR是HIV感染中直接测定病毒本身的最佳途径。定量PCR旨在评估样本中靶基因的分子数。用PCR对靶基因定量，是根据一定循环次数后,PCR产物的量来推断样品中原始模板的量。但山于日前技术卜-的原因，很难获得样品屮某一苹因的绝对数量，而往往是通过设置内参标或外参标来作相对的定量。其屮外参标法屮主要YfPCR产物的直接定量法，极限稀释法；内参标法中主要有同步扩

7、增法和竞争性PCR等。四、PCR的相关问题1、模板的选择和提取日前作为诊断和研究的标木多釆用外周血，此外也可在脑脊液、表皮组织、唾液和精液中来提取模板。多采川粗制细胞裂解液或冰冻血液宜接进行扩增。2.选择合适的引物引物设计的原则：•选择缺乏—级结构的保守区。gag,tat,env,pol•引物氏度18-30个核廿酸。•引物不能与其它嗜人淋巴细胞病毒和人细胞DNA同源。•可设计曜式”引物。•在用于临床标本前，要鉴定引物特异性。2.扩增产物的检测和分析可采用凝胶电泳法，限制性内切酶法，测序法及分了杂交分析法。凝胶电泳法可初步判断PCR产物的特

8、异性，限制性酶切法可进一步表明产物的特异性，而核廿酸测序技术则是检测PCR产物特异性的最可靠办法。分了杂交分析既是检测产物特异性的一个好方法，乂是检测扩增产物上碱基突变的冇效方法。五、实例PC