MHCC97中边缘群细胞的成瘤性及其侵袭性观察.doc

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1、MHCC97中边缘群细胞的成瘤性及其侵袭性观察作者：张毅，窦科峰，宋文杰，霍斌亮，张福琴【摘要】目的：分离肝癌细胞系MHCC97中边缘群细胞并观察其成瘤性和侵袭性.方法：利用流式细胞荧光激活分选法将肝癌细胞系MHCC97分成边缘群(SP)和主群(MP)细胞两个亚群.对两个亚群细胞分别采用软琼脂克隆形成实验和裸鼠成瘤试验观察其体内外成瘤能力；Transwell小室法检测两个亚群细胞的体外侵袭力.结果：SP细胞的体外克隆形成率为57%,MP细胞仅为13%；1X103个SP细胞可在4wk后形成明显的皮下移植瘤

2、(2/8),MP细胞则需1X105个才能成瘤(2/8).Transwell侵袭试验结果显示，SP表型细胞穿过人工基底膜的细胞数为(土)个，MP表型细胞仅为(土)个.结论：肝癌细胞系MHCC97中SP亚群的成瘤性和侵袭性均强于MP亚群细胞，表明SP表型的细胞在肝细胞癌的生长、转移中具有重要的地位.【关键词】肝细胞癌；边缘群；肿瘤干细胞；侵袭0引言目前对干细胞和肿瘤细胞之间关系的研究表明：恶性肿瘤是由一小群具有干细胞特性的肿瘤细胞即肿瘤干细胞(cancerstemcell,CSC)[1]引起.CSC在肿瘤形

3、成、生长以及浸润和转移中起着决定性作用.我们采用流式细胞荧光激活分选肝癌细胞系MHCC97中边缘群(SP)亚群和主群(MP)亚群并研究其成瘤性和侵袭性.初步分析边缘群细胞与肝癌生长和转移的关系.1材料和方法材料MHCC97细胞系(人高转移肝癌细胞系)购自上海复旦大学中山医院肝癌研究所.裸小鼠(BALB/c)48只，雌雄兼用，4〜6wk龄，体质量15〜18g；DMEMF12培养基、小牛血清(Gibco公司)；Hoechst33342、维拉帕米、碘化丙锭(PI)(Sigma公司)；FACSAdvantage

4、II型六色荧光流式细胞仪(美国BD公司)；Transwell小室(Costar公司)；Matrigel,经维拉帕米阻断后SP细胞比例减少至%.软琼脂集落形成率实验SP和MP细胞在软琼脂培养基中培养2wk后均可见明显的桑棋样细胞克隆形成.但在细胞克隆的大小和克隆形成率上MP细胞明显小于SP细胞.计数24个细胞以上的克隆细胞团，SP组为57%,MP组仅为13%.图1流式细胞分选图A：SP；B：MP.图2MHCC97边缘群和主群细胞15d形成的克隆X100裸鼠成瘤试验接种1X103的SP细胞便可在4wk后形成

5、明显的皮下移植瘤(2/8)；1X104SP组中有6只裸鼠成瘤；1X105SP组全部成瘤.MP细胞需1X105细胞才能形成皮下移植瘤(2/8),1X104和1X103MP组均不能成瘤.在相同接种细胞数量的情况下，SP细胞形成的肿瘤体积大于MP细胞(图3).常规HE染色可见裸鼠皮下肿瘤呈典型的移植瘤特点.细胞侵袭力检测SP表型细胞穿过人工基底膜的细胞数为个，MP表型细胞仅为个.两组间差异有统计学意义和主群细胞30d成瘤3讨论目前利用干细胞通用分子标记ABC转运蛋白(ATPbindingcassettetra

6、nsporter)高效外排荧光染料的特性进行SP细胞分选［2-3］.XX年，Kondo等［4］在C6,MCF7,Blo4和Hela4个细胞系中检测到了SP细胞，并提示SP是适用于肿瘤干细胞检测与分选的一种方法.我们对肝癌细胞系MHCC97流式分选出SP和MP细胞两个亚群.从实验数据上看，无论是软琼脂克隆形成的体外实验还是裸鼠成瘤的体内实验，SP细胞均表现出明显强于MP细胞的增殖和成瘤能力.这与造血系统、人乳腺癌及神经系统肿瘤中肿瘤干细胞比非干细胞具有更高的成瘤潜能一致［5-6］.但实验中1X105MP组

7、也有肿瘤形成，其原因可能是这种通过干细胞功能学标志得到得SP亚群并不能代表所有的肿瘤干细胞.Tu等［7］认为干细胞的迁移和癌细胞的转移皆受特异化学因子及其受体的调节.干细胞能够迁移到特定的组织和器官，而这可以解释肿瘤转移也有一定器官和组织特异性.Ho等[8]也证实在肺癌中SP亚群细胞具有强于其它细胞的侵袭能力.目前利用Matrigel胶重建基底膜系统是体外研究肿瘤细胞侵袭和转移行为的简便且快速的方法[9].细胞侵袭穿过重建Matrigel的能力反映该细胞的侵袭能力.实验结果表明SP细胞24h穿过人工基底

8、膜的细胞数远多于MP亚群.提示SP亚群细胞的存在可能是导致肝癌转移和复发的主要原因之一.我们的结果表明，肝癌细胞系MHCC97中SP亚群细胞具有很强的成瘤性和侵袭性，也表明其具有一定的干细胞特性.与上述结论相关的具体分子机制及直接因果关系还有待进一步探讨，目前尚不能证明SP亚群中百分之百的细胞都具有干细胞特性，同时并非所有肿瘤干细胞都具有SP特性[10].若结合其他干细胞表面标志如Sea1,ckit,CK7,Thy1[11]可进一步纯化具有