mhcc97中边缘群细胞的成瘤性及其侵袭性观察

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1、MHCC97中边缘群细胞的成瘤性及其侵袭性观察张毅，窦科峰，宋文杰，霍斌亮，张福琴【摘要】目的:分离肝癌细胞系MHCC97中边缘群细胞并观察其成瘤性和侵袭性.方法:利用流式细胞荧光激活分选法将肝癌细胞系MHCC97分成边缘群(SP)和主群(MP)细胞两个亚群.对两个亚群细胞分别采用软琼脂克隆形成实验和裸鼠成瘤试验观察其体内外成瘤能力；Transcell,CSC)〔1〕引起.CSC在肿瘤形成、生长以及浸润和转移中起着决定性作用.我们采用流式细胞荧光激活分选肝癌细胞系MHCC97中边缘群(SP)亚群和主群(MP)亚群并研究其成瘤性和侵

2、袭性.初步分析边缘群细胞与肝癌生长和转移的关系.1材料和方法1.1材料MHCC97细胞系(人高转移肝癌细胞系)购自上海复旦大学中山医院肝癌研究所.裸小鼠(BALB/c)48只，雌雄兼用，4～6a公司)；FACSAdvantageII型六色荧光流式细胞仪(美国BD公司)；Transa公司).1.2方法1.2.1MHCC97细胞培养用含100mL/L小牛血清,1×105u/L青霉素,1×105u/L链霉素的DMEMF12培养液,在37℃，50mL/LCO2饱和湿度条件下培养MHCC97细胞,2.5g/L胰蛋白酶消化液消化、传代,实验选

3、用对数生长期细胞.1.2.2SP，MP细胞的分选①细胞染色：胰酶消化MHCC97细胞，调整细胞密度为1×106/L.加入荧光染料Hoechst33342使终浓度为6mg/L.取1/10体积加好染料的细胞悬液加入维拉帕米，终浓度50μmol/L.37℃避光水浴90min，冰上10min.分选前制备成单细胞悬液，加入PI至终浓度为2mg/L.②流式细胞仪检测：355nmUV激发光源，610nm双色短通反射滤镜，450nm和675nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分.测量前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)二维参数图，检测细胞

4、均一性，以Hoechstred为X轴，Hoechstblue为Y轴作二维散点图，将低Hoechstred及低Hoechstblue且维拉帕米组缺失的区域设定为SP细胞的“门”，计算百分比，分选出SP，MP细胞.1.2.3双层软琼脂集落形成率实验于24孔板中,下层低熔点琼脂浓度为6g/L,上层为3g/L,每孔上层低熔点琼脂含细胞数为100个,SP，MP细胞各铺5孔.在37℃，50mL/LCO2及饱和湿度环境下培养2或含24个细胞以上的克隆.计算克隆形成率=克隆形成数/接种细胞数×100%.1.2.4裸鼠成瘤试验将分选的SP，MP细胞

5、计数，倍比稀释法调整浓度，按1×105，1×104，1×103的数量行裸鼠背部皮下接种注射，每个浓度组8只，每3d观察1次肿瘤形成情况及测量肿瘤大小,连续观测4微孔聚碳酸酯膜的TransL/LCO2培养24h，用棉签擦去微孔膜上室面的细胞，甲醛固定，HE染色，400倍显微镜下随机选择5个视野，统计视野中细胞数，以侵袭细胞的相对数表示肿瘤细胞的侵袭能力.每组重复试验3次.统计学处理:计量资料用x±s表示，两组间比较采用t检验，应用SPSS12.0软件处理.2结果2.1SP细胞和MP细胞的分选前向散射和侧向散射二维参数图分析癌细胞形态

6、、大小、胞质均匀性较一致，PI染色去除死细胞.Hoechst33342蓝光和红光的双参数图中SP细胞位于左下角两种荧光均阴性或很弱的区域,无维拉帕米组SP细胞比例约为3.9%（图1）,经维拉帕米阻断后SP细胞比例减少至0.5%.2.2软琼脂集落形成率实验SP和MP细胞在软琼脂培养基中培养2P细胞明显小于SP细胞.计数24个细胞以上的克隆细胞团，SP组为57%，MP组仅为13%（图2）.图1流式细胞分选图A：SP；B：MP.图2MHCC97边缘群（SP）和主群（MP）细胞15d形成的克隆×1002.3裸鼠成瘤试验接种1×103的SP

7、细胞便可在4P细胞需1×105细胞才能形成皮下移植瘤(2/8)，1×104和1×103MP组均不能成瘤.在相同接种细胞数量的情况下，SP细胞形成的肿瘤体积大于MP细胞(图3).常规HE染色可见裸鼠皮下肿瘤呈典型的移植瘤特点.2.4细胞侵袭力检测SP表型细胞穿过人工基底膜的细胞数为（66.6±4.0）个，MP表型细胞仅为（18.2±1.9）个.两组间差异有统计学意义（P0.01).A:1×105SP;B:1×104SP;C:1×103SP;D:1×105MP.图3MHCC97边缘群（SP）和主群（MP）细胞30d成瘤3讨论目前利用干

8、细胞通用分子标记ABC转运蛋白(ATPbindingcassettetransporter)高效外排荧光染料的特性进行SP细胞分选〔2-3〕.2004年，Kondo等〔4〕在C6，MCF7，Blo4和Hela4个细胞系中检测到了SP细胞，并提