《研究方法和手段》PPT课件.ppt

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1、第三章细胞生物学研究方法和手段一、显微镜技术二、细胞的分离及培养三、细胞组分的分离分离四、细胞内分子的示踪五、基本的分子生物学实验技术第一节显微镜技术光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。电子显微镜：以电子束为光源。普通光学显微镜1.构成：①照明系统②光学放大系统③机械装置2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。（一）普通光学显微镜3.分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。R=0.61λ/N．A．N．A．＝ｎsinα/2式中：n=介质折射率；α=镜口角（标本对物镜镜口的张角），N.A.=镜口率（numericaperture）。镜口角总是要小于180˚，所以si

2、na/2的最大值必然小于1。思考：如何提高显微镜的分辨能力？几种介质的折射率介质空气水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66显微镜的几个光学特点：制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。sinα/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。荧光显微镜Fluorescencemicroscope特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式。Fluorescenceimageofepithelialcell,DNA

3、inblueandMicrotubulesingreen用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。激光共聚焦扫描显微境Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。laserconfocalscanningmicroscope,LCSMLCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucle

4、us(blue)（四）暗视野显微镜darkfieldmicroscope聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。可观察4~200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。环形光阑（annulardiaphragm）：位于光源与聚光器之间相位板（annularphaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ

5、。相差显微镜原理用途：观察未经染色的玻片标本偏光显微镜polarizingmicroscope用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（与起偏器方向垂直的偏振片）。载物台是可以旋转。淀粉倒置显微镜inversemicroscope物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。电子显微镜(Electronmicroscope)1932年德国学者MaxKnolls和ErnstRuska用波长比光短得多的电子作光源,发明

6、了第一台电子显微镜，大大提高了显微镜的分辨率，开拓了超微世界。电子显微镜概述电子显微镜的基本结构电子显微镜基本结构由三大部分组成:●电子光学系统由照明系统、标本室、成像系统、观察窗和记录用的照相机等组成；●真空系统是保持电镜的真空度；●电子学系统即供电系统，需要高压稳压。以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2µm、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopicstructures）

7、。不同光线的波长透射电子显微镜透射电子显微镜TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM扫描电子显微镜20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。Scanningelectronmicroscope（SEM