细胞研究方法ppt课件.ppt

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1、第三章细胞生物学研究方法1第一节细胞形态结构观察方法一、光学显微镜技术二、电镜技术三、扫描隧道显微镜细胞形态结构观察方法细胞组分分析方法细胞培养、细胞工程与显微操作技术2分辨率(resolution)R=0.61λ/ｎ•sinθ其中λ为入射光线波长；n=介质折射率；θ=样品对物镜镜口张角的半角在光学显微镜中，照明系统是可见光，使用的是玻璃透镜系统，可直接通过目镜观察镜像。3分辨率——区分两质点间最小距离人眼为0.2mm，光镜为0.2μm电镜为0.2nm最大放大倍数＝人眼/光镜分辨率放大倍数10004普通光学显微镜5相差显微镜6Fluoresc

2、encemicroscopeFluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandmicrotubulesingreen荧光显微镜特点：光源紫外线波长较短分辨力高72.1.5激光扫描共聚焦显微境（Laserscanningconfocalmicroscope,LCSM）用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，能扫描不同层次，形成立体图像。8laserconfocalscanningmicroscope,LCSM9在光学显微镜中，照明

3、系统是可见光，使用的是玻璃透镜系统，可直接通过目镜观察镜像。在电子显微镜中，照明系统为电子束，使用电磁透镜，通过荧光屏观察样品的镜像。10制片（样）技术通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。1112光学显微镜、TEM、SEM成像原理比较13冰冻蚀刻freeze-etching快速冷冻低温断裂断裂面蚀刻复型142.2.2扫描电子显微镜Scanningelectronmicroscope（SEM）15细胞组分分析方法（cellfractionationpurification）

4、差速离心和密度梯度离心法分离大分子细胞组分显示方法FeulgenSchiffPAS特异蛋白抗原定位定性IFIEM特异核酸序列定位与定性ISH放射自显影定量细胞化学分析技术FCM16一、超速离心分离细胞器和大分子步骤①匀浆—将细胞破碎保留细胞器（超声、研磨、冻融）②分级分离—离心③分析—化学组成、功能171.差速离心(differentialcentrifugation)2.密度梯度离心18差速离心法differentialcentrifugation原理：由低速到高速逐渐沉降将不同大小的颗粒分离。匀浆离心1000G20分钟细胞核线粒体等离心15

5、000G120分钟微粒体离心0.26%脱氧胆酸钠15000G20分钟核糖体等离心20分钟10000G差速离心法19不同的细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数20五、放射自显影术autoradiography原理：利用放射性同位素所放射出的射线作用于感光乳胶的卤化银晶体，从而产生潜影，再通过显影把感光的卤化银还原为黑色的金属银颗粒，根据感光乳胶上的银粒所在的部位和黑度来判断样品中的放射性物质分布的位置和强度。放射自显影的三种类型宏观自显影光镜自显影电镜自显影放射自显影的主要步骤：放射性同位素标记制片涂乳胶烘干曝光显影定影观察21显微分光光度

6、术流式细胞术（flowcytometry,FCM)检测细胞及其组分的物理和化学特性，可对细胞进行分选，还可以检测细胞及其组分的多种结构和功能参数。六、定量细胞化学分析技术2223第三节细胞培养细胞工程显微操作一、细胞培养Cellculture一门科学，一门技术，应用广泛二、细胞工程细胞融合细胞杂交单克隆抗体显微操作2425本章要点1.细胞培养（cellculture）2.原代培养(primaryculture)3.传代培养(secondaryculture)4.细胞系(cellline)5.细胞株（cellstrain)细胞生物学研究的方法（原

7、理）与应用26