DNA的重组与鉴定ppt课件.ppt

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1、实验九DNA的重组与鉴定1一.实验目的通过本实验学会重组DNA的原理与方法。2基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA分子。重组DNA质粒DNA基因片段3二、实验原理外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成的新的共价键，如质粒载体的两条链都带有5’磷酸，可生成4个新的磷酸二酯键，但如果质粒DNA已经去磷酸化，则只能行成2个新的磷酸二脂键，在这种情况下产生的杂交体分子带有2个单链切口，当杂交体分子导入感受态细胞后可被修复。4实验原理相邻的5’磷酸和3’羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大

2、肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。5重组DNA技术基本原理：切、接、转、筛6多种酶切口多克隆位点限制性内切酶单一酶切口7限制性内切酶酶切切酶切89磷酸二酯键的形成DNA连接酶DNA连接酶DNA连接酶目的基因与载体的连接接10T4-DNA连接酶：T4-噬菌体连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm）≤15℃：15℃/6h；12℃/8h；8℃/12h；11连接方式：相同粘性末端的连接平头末端的连接不同粘性末端的连接人工粘性末端的连接12粘端连接CCGGCCGGGGCCGGCCCGGCCGGCCGGCCGGCCCGGGGCCHapⅡT4-DNA连接酶13平端连接AGCTTCGAA

3、luⅠDNA连接酶AGCTAGCTTCGATCGA14重组体的转化受体细胞转15JM109感受态含氨苄平板Am重组质粒感受态16原核细胞的转化（细菌转化）1)受体细胞的选择限制缺陷型:避免修饰和降解重组缺陷型：避免重组整合转化亲和型：较高的可转化性遗传互补型：利于筛选感染缺陷型：防止感染172）转化方法CaCl2诱导转化电穿孔PEG介导转化人工体外包装特殊处理受体细胞细胞膜特性改变18CaCl2处理受体细菌50-100mmol/LCaCl2感受态细菌重组体转入细菌19含氨苄平板连接目的基因基因载体连接酶转化重组体克隆的筛选与鉴定筛宿主细胞20转化后的克隆群体：211.遗传检测法1）

4、抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板222）标志补救（ß-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段23X-galLacZ蓝色化合物X-gal24（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶252电泳检测法凝胶电泳检测加样孔DNAMarker空质粒重组质粒重组质粒酶切重组质粒的PCR扩增片段26原位杂交3菌落杂交筛选法27三、实验仪器28超净工作台29台式高速冷冻离心机30恒温空气摇床31恒温培养箱培养皿32恒温水浴锅33四、材料及试剂E.coliDH5αpUC19orT载体λDNA34四、材料及试剂1

5、.T4DNA连接酶2．10×T4DNA连接酶缓冲液:400mmol/LTris-ClpH7.5100mmol/LMgCl2100mmol/LDTT,500μg/mlBSA5-10mmol/LATP35试剂灭菌去离子水Kac(3mol/L，pH5.2)Xgal(20mg/ml)IPTG(200mg/ml)36五、实验步骤1.混合以下溶液于一个无菌离心管中xμlpUC19质粒(0.1-4μg)2μl10×酶切缓冲液1－5U限制性内切酶（EcoRI）yμl去离子水终体积为20μl2.在推荐温度下育温1小时（一般为37℃）加入5μl电泳缓冲液终止反应，电泳检测结果。酶切37实验步骤1．混合

6、以下试剂PCRDNA6μlpUC19酶切回收DNA1.0μl5×T4DNA连接酶缓冲液2.0μlT4DNA连接酶(10u/μl)1μl10μl混合液于16℃培养12小时连接38转化及筛选连接子的转化及筛选同实验一。39实验结果40实验报告简述实验目的和实验原理及材料与试剂;详述实验步骤；画出实验结果示意图并分析。41