不同剂量刀豆蛋白A腹腔注射诱导昆明小鼠肝纤维化效果观察.doc

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1、不同剂量刀豆蛋白A腹腔注射诱导昆明小鼠肝纤维化效果观察【摘要】目的观察不同剂量刀豆蛋白A（ConA）诱导昆明小鼠肝纤维化的效果，探讨其最佳剂量及成模时间。方法昆明小鼠96只，随机分为低剂量ConA组（A组）、中剂量ConA组（B组）、高剂量ConA组（C组）及正常对照组（N组），每组24只，分别经腹腔注射ConA-PBS溶液15mg/kg.20mg/kg.25mg/kg及PBS溶液，每周一次。于注射6、7、8、9周后分批处死各组昆明小鼠6只，测ALT、AST,肝脏作病理学检查。结果实验组ALT、AST一直明显增高，B组第8周出现典型的肝纤维化病理改变

2、，且无动物死亡。结论20mg/kgConA腹腔注射是合适的剂量，每周1次，注射8次可建立肝纤维化动物模型。【关键词】肝纤维化；动物模型；刀豆蛋白A合适的动物模型是研究肝纤维化的重要工具，我们已经采用ConA进行反复腹腔注射的方式成功建立昆明小鼠肝纤维化模型[1],此次期望通过改进和完善找到最佳剂量和成模时间，使之成为简便、价廉、可重复性好的动物模型。1材料与方法1.1实验动物①实验动物：昆明小鼠96只，体重在18-22g,由江苏大学动物实验中心提供，均适应环境一周后开始实验；②主要试剂：ConA购于sigma公司。1.2实验方法1.2.1动物分组昆明

3、小鼠96只，随机平均分为4组，每组24只：低剂量ConA组（A组）、中剂量ConA组（B组）、高剂量ConA组（C组）和正常对照组（N组b1.2.2动物的处理A组、B组、C组及N组分别经腹腔注射ConA溶液15mg/kg.20mg/kg.25mg/kg及PBS溶液，每周一次。于注射6、7、&9周后（注射后24h）分批摘除小鼠眼球取血，将取血后的小鼠颈椎脱臼处死，取出肝脏，每组6只。1.2.3观察指标及检测①血浆ALT、AST:小鼠摘除眼球取血，采用全自动生化仪测定ALT及ASTo②病理学检查：HE染色肝组织常规病理，Masson胶原染色，半定量计分系

4、统（SSS）评估纤维化程度。1.3统计学处理所有计量资料用x士s表示，采SPSS17.0.统计分析软件进行数据处理，PAST,B、C组AST>ALT,见表1、2o表1各组小鼠血清ALT水平变化（u/l）n6周7周8周9周N639.00±5.4841.67±6.1940.17±5.7139.33±4.63A6182.83±35.28175.00±12.98174.67±15.86170.33±14.80B6230•仃±40.70*209.83±25.36#198.33±16.27#194.50119.15#C4308・75±55・60#261.25±3

5、2.45#259.50±9.75^237.25±24.60#注：A、B、C组分别与N组比较：P0.05,#P0・05;B、C组分别与N组比较：P0.05;C组与A组比较：P0.05o3讨论合适的动物模型是研究肝纤维化的重要工具。我国培育的昆明小鼠价廉，易饲养，抗病力强。腹腔注射具有作简便快速，动物痛苦小的优点。ConA为单组分药物，反复注射ConA可以诱导肝细胞慢性损伤,持续激活HSC,而发生肝纤维化，这与HBV致肝纤维化的发病机制类似［2Jo反复肝损伤可以激活肝星状细胞，最终导致肝纤维化。作为肝细胞损伤较为敏感的检测指标，当肝细胞严重损伤时AST的

6、释放多于ALT,ALT、AST的比值指示肝脏疾病的进程［3］□实验中，各剂量组的AST、ALT明显高于正常组，剂量越大，ALT、AST越高，且AST更为明显，而在中剂量及高剂量组,AST>ALT,说明ConA剂量越大，对肝细胞损伤严重，这与以往文献报道一致[4],同时证实了反复注射ConA引起的肝损伤，与人类慢乙肝反复肝损、最终形成肝纤维化的过程相似[5Jo确诊肝纤维化的金标准是病理学检查，我们发现A组第9周、B组第8周、C组第7周岀现典型肝纤维化病理表现，另外，在本实验中病理切片可见淋巴细胞浸润，与人肝炎肝纤维化病理切片表现相近，这是其他动物模型少

7、有的[6]o肝纤维化半定量计分系统(SSS)是2002年由中华肝脏病学会肝纤维化学组提出的，它代表的是病变的相对严重程度[7],各剂量ConA组的肝纤维化半定量计分与病理检查结果一致，通过各组肝纤维化半定量计分分析发现，同周次ConA剂量越大，计分越高；同一剂量，时间越长，计分越高，且有显著相关,提示ConA诱导小鼠肝纤维化具有剂量及时间依赖性。在实验过程中，A组未发现动物明显不良反应，第9周岀现典型肝纤维化表现；B组虽有1只小鼠出现不良反应，但未出现动物死亡，第8周出现典型肝纤维化表现；C组虽在第7周即岀现典型肝纤维化表现，但有2只小鼠死亡，为注射

8、后随即出现皮肤黏膜明显紫纟甘，呼吸急促，最终死亡，故考虑可能为过敏所致。总之，采用ConA反复腹腔注射昆明小