大肠杆菌K88相关产品的研制.ppt

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1、大肠杆菌口服疫苗的研制汇报人:范群平生物制品实验室Whatisvaccine？广义的疫苗是为了预防、控制传染病的发生和流行而接种于机体的预防性生物制品。生物制品，是指用微生物或其毒素，人或动物的血清、细胞等制备的用来预防、诊断和治疗用的制剂。预防用的抗体制剂也可以归类为疫苗Whatisoralvaccine？口服疫苗，顾名思义，就是经“口”途径接种的疫苗，进一步来说是经过消化道途径进行接种的疫苗。Whychoosetheoralvaccine？首先，口服疫苗避免了注射疫苗造成的惊吓应激，有效保护了动物福利。其次，口服疫苗降低了养殖成本，

2、例如人力成本、抗应激产品的成本。最后，对于许多经肠道和黏膜表面感染的致病微生物有较好的防御能力。口服疫苗具有巨大的市场前景！WhydowechoosetheE.Coli?之所以选择大肠杆菌作为研究对象，就是因为仔猪大肠杆菌病是猪的常见传染病之一，发病率、死亡率高达50%~100%，直接给猪场造成巨大的经济损失。治疗不及时，即使恢复也变成僵猪，影响仔猪的生长发育，造成饲料的浪费，间接影响猪场的经济效益。WhyistheK88?1、大肠杆菌的致病性取决于它在小肠的粘附、定植、增殖以及产生毒素的能力，粘附因子或纤毛决定细菌定植的能力，一旦发生

3、细菌定植，就会快速增值并产生毒素从而导致腹泻的发生。2、经过流行病学调查，我们发现导致仔猪大肠杆菌病的的最主要的粘附因子就是3、K88几乎100%由蛋白质组成，具有较强的免疫原性。K88HowtopreventandtreattheE.Colidisease?最好的方法就是应用为此，根据仔猪免疫系统的发育情况，我们设计了两种抗体应用方案：一、早期直接抗体应用方案鸡抗猪产肠毒素大肠杆菌（K88）卵黄抗体的研制二、后期间接抗体应用方案携带猪源产肠毒素大肠杆菌(k88)抗原基因的口服乳酸菌疫苗的开发及应用抗体一、鸡抗猪产肠毒素大肠杆菌（K88

4、）卵黄抗体的研制Whydowechooseyolkantibody（IgY）?1、抗体水平高卵黄抗体所含有的抗体滴度大于血清中的抗体滴度，作为饲料添加剂具有更高的免疫保护效率。2、稳定性高卵黄抗体具有很高的热稳定性，便于机械生产、加工。3、安全性高卵黄抗体可以用来防治相应的病原体引起的感染并且无药物残留、不产生耐药性。4、用途广泛纯化的卵黄抗体可以用来诊断疾病并且具有经济省时省力的特点。Researchmathods1、产肠毒素大肠杆菌（K88）菌株的分离鉴定以及扩大培养培养基+诱导剂37℃、220rpm24小时震荡培养名称猪大肠杆菌猪

5、沙门氏菌培养基猪大肠杆菌培养基疫苗生产用猪沙门氏菌培养基疫苗生产用细菌计数2.5×109cfu/ml1×109cfu/ml表1：细菌计数结果2、经过SDS-page实验证明K88粘附素蛋白表达了以后，进行细菌计数，以保证有较高的细菌数来用于疫苗制备。3、疫苗的制备1、菌株的灭活在菌液浓度为1×109cfu/mL的细菌悬液中加入终浓度为3‰的甲醛溶液，37℃恒温振荡作用48h。2、灭活效果鉴定灭活苗12灭活前细菌计数109cfu/mL109cfu/mL灭活后细菌计数003、疫苗的乳化将配制好并高压灭菌的油相佐剂与灭活的菌液按照1:1的比例

6、混合，并用匀浆仪乳化，乳化期间不定时抽样检测疫苗的乳化效果乳化好的灭活疫苗呈乳白色牛奶状，滴入清水中时不溶解，不扩散，不沉淀。4、预接种实验为了检验动物实验设计的科学性和可行性，避免设计不周造成浪费，我们设计了预实验。预实验证明以6×109cfu的量免疫效果最好，免疫鸡群一开始出现应激反应，采食量下降、精神抑郁，趴卧不起。接种一周后鸡群恢复正常，没有出现实验鸡只死亡。免疫170日龄待开产鸡，鸡群分为2组，每组100只，一组为对照组，一组为实验组。1、首免每羽注射1.0mL。2、两周左右进行二免，方法同初免，每羽注射1.5ml。3、四周后

7、进行三免，方法同初免，每羽注射2.0ml。4、每周收集卵黄液，采用试管直接凝集法进行卵黄液中卵黄抗体效价的测定。5、免疫待开产鸡群，诱导免疫应答，产生高抗体水平的鸡蛋样品编号12345678910111213抗体效价（log2）3666.57.58989111010106、免疫鸡群的抗体效价变化表3：免疫鸡群大肠杆菌k88抗体效价免疫鸡群的抗体效价变化以上结果表明：免疫蛋鸡在免疫后卵黄中的特异性抗体开始明显升高，10周达到高峰，并持续到13周。收集免疫鸡10~13周产的鸡蛋，进行喷干工艺的摸索，最后确定喷干时进口温度设定为160℃，出口

8、温度设定为90℃，对卵黄抗体滴度无影响，并且易于操作。7、卵黄抗体的喷雾干燥指标色泽粒度粗蛋白消化率卵黄抗体粉初产品淡黄色80目12.6%97.6%8、卵黄抗体粉指标测定保存条件：常温下放置半年，卵黄抗体活