致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌相关特异蛋白的鉴定及其单克隆抗体的研制

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1、致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌相关特异蛋白的鉴定及其单克隆抗体的研制IdentificationofspecificproteinsofEscherichiacoli‘-‘■’-·---·-。-●’associatedwitnsalpinRitJs-peritonitisin2eeseandpreparationofMonoclonalantibody研究生：张勇攀导师：秦爱建教授金文杰副教授资助项目：国家自然科学基金青年基金项目30800822教育部创新团队(Il汀0978)江苏省优势学科建设项目扬州大学2012年5月张勇攀：致鹅卵黄

2、性腹膜炎大肠杆菌相关特异蛋白的鉴定及其单克隆抗体的研制致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌相关特异蛋白的鉴定及其单克隆抗体的研制YIDIII12IIIIl2Illl5118IIIIIl4IIIl8IIIII攀研究生：张勇攀导师：秦爱建教授金文杰副教授摘要鹅卵黄性腹膜炎，又称为鹅蛋子瘟，是一种主要发生于产蛋种鹅，引起种鹅生产性能下降甚至死亡的疾病。该病主要是母鹅生殖系统尤其是输卵管感染大肠杆菌出现炎症，继而成熟的卵子不能正常进入输卵管掉入腹腔中，导致卵黄性腹膜炎。如果该病不能及时发现并给予治疗，轻的导致产蛋母鹅生产性能下降甚至绝产，严重的导致产

3、蛋母鹅的死亡，造成巨大经济损失。自上世纪六十年代首次报道该病以来，我国江苏、湖北、广东、河南、安徽、广西、四川等地都有相关诊疗与预防的报道。国外仅少数学者对产蛋鸡卵黄性腹膜炎及其共感染病原进行了相关报道。本研究运用蛋白质组学技术探寻鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌特异性蛋白，希望能为揭示鹅卵黄性腹膜炎发生机理、为临床预防和控制鹅卵黄性腹膜炎的发生提供重要的理论依据。1．致鹅卯黄性腹膜炎特异性蛋白的鉴定为了找出致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌的差异蛋白，本研究分别取致鹅卵黄性腹膜炎菌株G837、G803、G8107进行蛋白质分析，同时用致鹅肝周炎大肠

4、杆菌菌株E00560、E0060、致鸡败血症大肠杆菌菌株251作为对照，提取全菌蛋白进行二维电泳(two．dimensionalelectrophoresis，2一DE)，2-DE图谱经PDQuest8．0．1软件分析后，发现了鹅蛋子瘟大肠杆菌菌株特异性的蛋白点42个，对差异显著的25个点送南方医科大学生命科学院进行质谱分析，结果获得了21个差异蛋白。运用PCR和RT．PCR对其中11个蛋白基因进行扩增分析，结2扬州大学颂士学位论文果表明，大多数蛋白在普通大肠杆菌中均存在相同编码基因，但30S核糖体蛋白$6(30Sribosoma

5、lproteinS6，RPS6)仅在鹅源致病性大肠杆菌中特异性表达，KASI(3．oxoacyl．[acyl．carrier．protein】synthaseI)仅在致鹅卵黄性腹膜炎的大肠杆菌中表达，这一发现提示，这两种蛋白可能与致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌相关，该结果为进一步研究鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌致病机理打下了基础。2．RPS6蛋白的原核表达及纯化根据二维电泳质谱分析结果中提供的己发表的基因序列(登录号：gil218707811lret[1YP002415330．1)，设计合成了一对针对RPS6的特异性引物，在上下游引物中分别添

6、加了BamHI和HindIII的酶切位点。用PCR的方法从致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌中扩增出了RPS6基因。将扩增的目的片段克隆至pGEM．TEasy载体中，阳性克隆测序分析表明，目的基因长度为396bp，其与已报道的序列同源性为99．7％。用BamHI和HindIII双酶切pOEM．T-RPS6重组质粒，获得RPS6基因片段，然后连接至经BamHI和HindIII双酶切后的pET-32a(+)表达载体中，经双酶切鉴定后，将含有RPS6基因的阳性重组质粒转化至：lJE．coliDE3(BL21)感受态细胞中，筛选重组菌pET-32a

7、(+)．RPS6／DE3，用IPTG诱导表达。SDS．PAGE分析结果表明，构建的重组蛋白His．RPS6在大肠杆菌中获得了可溶性表达，分子量约为34kDa，大小与预期相一致。用HisTrapFF镍柱对His．RPS6融合蛋白进行了纯化，结果得到了纯度很高的重组蛋白，为进一步研究提供了条件。3．抗RPS6蛋白单克隆抗体的制备及鉴定利用大肠杆菌大量表达融合蛋白His．RPS6，并纯化，将其作为抗原免疫BALB／C小鼠，取其脾细胞与SP2／0细胞进行融合，以表达及纯化后的融合蛋白His—RPS6和表达His的大肠杆菌超声波裂解物分别作

8、为包被抗原，通过问接ELISA方法平行筛选获得了三株抗RPS6的单克隆抗体，分别命名为RPS6．2C2、RPS6．381和RPS6—5H7。Western．blot试验证实，本研究所获得的单克隆抗体均能与表达融合蛋白的His—RPS6反应，识别分子