离体培养神经干细胞中NMDA受体亚单位NR2B的表达.doc

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1、离体培养神经干细胞中NMDA受体亚单位NR2B的表达作者：胡忠浩，王珊珊，徐铁军【关键词】神经干细胞;NMDA受体亚单位2B;Western,blot摘要：目的研究离体培养的大鼠神经干细胞(NSCs)中N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体亚单位NR2B的表达。方法从孕18〜19天胎鼠海马中分离、培养、传代、鉴定NSCs,用免疫细胞化学、Westernblot免疫印迹检测传代1次NSCs中NMDA受体亚单位NR2B的表达。结果源自孕18〜19天胎鼠海马的NSCs,即可以表达NM-DA受体亚单位NR2B。结论体外培养的NSCs能表达NMDA受体亚单位NR2Bo关键

2、词：神经干细胞;NMDA受体亚单位2B;WesternblotAbstract:Object!veToinvestigatetheexpressionofNMDAreceptorsubunit2Bintheculturedneuralstemcells(NSCs)・MethodsNSCsfromthehippocampusofratsatembryonicdayl8-19wereisolated,cultured,passagedandidenti-fied・TheexpressionofN-methyl-D-aspartate(NMDA)receptorsub

3、unit2BinthepassagedNSCswasdeterminedbyim-niunocytochemistryandWesternblot・ResultsItwasfoundthatNSCsderivedfromthehippocampusofratsatembryonicdayl8-19couldexpressNMDAreceptorsubunit2B.ConclusionNSCscanexpressNMDAreceptorsubunit2Binvitro.Keywords:neuralstemcells;NMDAreceptorsubunit2B;W

4、esternblot自20世纪90年代以来，人们相继从哺乳动物中枢神经系统内，特别是成年人脑脑室周围的室管膜下层、齿状回颗粒下层、纹状体等部位分离培养出神经干细胞[]](neuralstemcells,NSCs)。NSCs的生长及分化与多种神经生长因子和神经营养因子有关，其中谷氨酸及其受体起着重要的作用。谷氨酸是体内一种主要的兴奋性氨基酸，它的过度释放可通过NMDA受体导致神经元和神经胶质细胞的死亡[2]o已有研究表明，在体外培养的神经元上表达N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体[3],那么NSCs是否表达NMDA受体，其对细胞会产生何种影响述不是很清楚。本实

5、验初步研究了NSCs±NR2B的蛋白质的表达。1材料和方法1.1材料孕18~19天SD(Sprague-Dawley)大鼠由徐州医学院实验动物中心提供。1・2主要试剂和仪器细胞培养试剂高糖DMEM.F12(1：1)、B27、重组人碱性成纤维生长因子(h-bF-GF)、垂组人表皮生长因子(h-EGF)均购自Gibco公司。抗体为：神经上皮干细胞蛋白(nestin)单克隆抗体(Sigma公司)、胶质原纤维酸性蛋口(GFAP)单克隆抗体(Sigma公司)、BTTI型微管蛋白(B-TTItubu-lin)单克隆抗体(Sigma公司)、山羊抗NR2B多克隆抗体（Santa

6、Cruz公司）、生物素标记兔抗山羊IgG和羊抗小鼠TgG（北京中杉生物试剂公司）、碱性磷酸酶标记兔抗山羊IgG（北京中杉生物试剂公司）、兔抗山羊FITC-IgG（JacksonlmmonoResearch公司）、山羊抗鼠TRITC-IgG（JacksonTmmonoResearch公司）、山羊抗鼠FTTC-TgG（JacksonlmmonoResearch公司）。DAB（北京中杉生物试剂公司）,多聚赖氨酸（Sigma公司），胎牛血清（FBS,杭州四季青生物试剂公司）。仪器:C02培养箱（Thermo,美国），荧光倒置相差显微镜（01ympusIX70,日本）,M

7、ini-PR0TEAN3Cell（BIORAD,美国），分光光度计（722N,上海），低温■高速离心机（Eppendorf,德国），蛋白质转膜仪（BTORAD公司）。1.3方法1.3.1大鼠胚胎NSCs的分离培养取孕18〜19天大鼠，麻醉后处死，消毒取胎鼠，将胎鼠置于0.5%碘伏中消毒，取脑，分离海马，置于盛有少量高糖DMEM.F12基础培养液的培养皿中；将组织尽量剪碎，加入基础培养液5ml,吹打制成细胞悬液，400目筛网过滤，台盼蓝染色，细胞计数，以2X109个细胞・L接种到6孔培养板内，最后加入h-EGF（20ug.L）和h-bFGF（20ug.L）,置37

8、°C、5%C02、95%