离体培养神经干细胞中nmda受体亚单位nr2b的表达论文

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1、离体培养神经干细胞中NMDA受体亚单位NR2B的表达论文胡忠浩，王珊珊，徐铁军【关键词】神经干细胞;NMDA受体亚单位2B;ethodsNSCsfromthehippocampusofratsatembryonicday18-19ethyl-D-aspartate（NMDA）receptorsubunit2BinthepassagedNSCsinedbyim-munocytochemistryandDAreceptorsubunit2B.ConclusionNSCscanexpressNMDAreceptorsubunit2Binvitro.Keycells;NMDAr

2、eceptorsubunit2B;DA受体导致神经元和神经胶质细胞的死亡［2］。已有研究表明，在体外培养的神经元上表达N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体［3］，那么NSCs是否表达NMDA受体，其对细胞会产生何种影响还不是很清楚。本实验初步研究了NSCs上NR2B的蛋白质的表达。1材料和方法1.1材料孕18～19天SD（Sprague-Daa公司）、胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）单克隆抗体（Sigma公司）、β-Ⅲ型微管蛋白（β-Ⅲtubu-lin）单克隆抗体（Sigma公司）、山羊抗NR2B多克隆抗体（SantaCruz公司）、生物素标记兔抗山羊IgG和羊抗小鼠I

3、gG（北京中杉生物试剂公司）、碱性磷酸酶标记兔抗山羊IgG（北京中杉生物试剂公司）、兔抗山羊FITC-IgG（JacksonImmonoResearch公司）、山羊抗鼠TRITC-IgG（JacksonImmonoResearch公司）、山羊抗鼠FITC-IgG（JacksonImmonoResearch公司）。DAB（北京中杉生物试剂公司），多聚赖氨酸（Sigma公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青生物试剂公司）。仪器:CO2培养箱（Thermo，美国），荧光倒置相差显微镜（OlympusIX70，日本），Mini-PROTEAN3Cell（BIORAD，美国），分光

4、光度计（722N，上海），低温高速离心机（Eppendorf，德国），蛋白质转膜仪（BIORAD公司）。1.3方法1.3.1大鼠胚胎NSCs的分离培养取孕18～19天大鼠，麻醉后处死，消毒取胎鼠，将胎鼠置于0.5%碘伏中消毒，取脑，分离海马，置于盛有少量高糖DMEM.F12基础培养液的培养皿中;将组织尽量剪碎，加入基础培养液5ml，吹打制成细胞悬液，400目筛网过滤，台盼蓝染色，细胞计数，以2×109个细胞.L接种到6孔培养板内，最后加入h-EGF（20μg.L）和h-bFGF（20μg.L），置37℃、5%CO2、95%空气、平衡湿度培养箱中，倒置显微镜观察。每7～1

5、0天传代1次。1.3.2NSCs的nestin鉴定取传代1次的神经干细胞球种于铺有多聚赖氨酸（100mg.L）的24孔培养板中，4h后行间接荧光免疫细胞化学染色:①4%多聚甲醛固定10～15min;②0.01mol.LPBS洗5min×3次;③10%羊血清37℃孵育30min;④加入抗nestin（小鼠单抗1∶500），4℃过夜，阴性对照组仅加一抗稀释液0.01mol.LPBS，其余步骤相同;⑤0.01mol.LPBS洗5min×3次;⑥加山羊抗鼠FITC-IgG荧光二抗（1∶200），37℃，1h;⑦0.01mol.LPBS洗5min×3次，倒置荧光显微镜观察拍照。1

6、.3.3NSCs的诱导分化及其鉴定将传代1次的神经干细胞球和培养液移入离心管，离心去除旧培养液，加含1%FBS的DMEM.F12，种于铺有多聚赖氨酸（100mg.L）的24孔培养板中，于12h～14天时，行免疫细胞化学反应:①4%多聚甲醛固定15min;②3%过氧化氢封闭15min;③10%羊血清37℃孵育30min;④分别加入抗β-Ⅲtubulin（小鼠单抗1∶1000）或抗GFAP（小鼠单抗1∶500）抗体，4℃过夜，阴性对照组仅加一抗稀释液0.01mol.LPBS，其余步骤相同;⑤加生物素标记羊抗小鼠IgG，37℃，30min;⑥加辣根过氧化物酶（HRP）标记的卵

7、白素-生物素复合物;⑦DAB.过氧化氢（0.05%.0.01%）呈色，倒置显微镜观察拍照。除血清和一抗之间外，其余各步间均以0.01mol.LPBS洗5min×3次。藉此区分神经元、星形胶质细胞，以鉴定NSCs的多分化潜能。1.3.4免疫细胞化学法检测NSCs中NMDA受体亚单位NR2B的表达取传代1次的神经干细胞球种于铺有多聚赖氨酸（100mg.L）的24孔培养板中，4h后，用NR2B（羊多抗1∶200）抗体行免疫细胞化学反应，步骤同上。1.3.5DA受体亚单位NR2B的蛋白表达①取传代1次的神经干细胞球，用PBS离心洗3次，离心后沉淀