疟疾分子生物学诊断技术.ppt

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1、疟疾分子生物学诊断技术疟疾的诊断2疟疾诊断RDTs1.疟疾快速诊断试剂；2.会出现假阳性或假阴性。分子生物学方法1.PCR方法；2.灵敏度较高，特异性强；3.鉴别虫种。显微镜检查1.金标准；2.要求镜检员有丰富的镜检经验，低密度时易漏检。流行史、临床表现1.流行季节去过流行区、输血史；2.周期性发冷、发热、出汗。疟疾的分子生物学诊断技术常用的用于疟疾诊断的分子生物学技术：普通PCR巢氏PCR半巢氏PCR复式PCR多重PCR实时荧光定量PCR3PCR的原理4高温变性模板DNA加热至93℃左右，DNA双链或经PCR扩增形成的双链D

2、NA变性，成为单链。低温退火模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；适温延伸DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。原理：在模板、引物、4种dNTPs和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。5PCR循环-第一步-加热变性6靶序列靶序列PCR循环-第二步-引物与靶序列退火7靶序列靶序列Primer1Primer

3、2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环-第三步-引物延伸8靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase第1个PCR循环完成后-得到两个拷贝的靶序列9靶序列靶序列BiotinBiotin30次循环后靶序列扩增的数量101cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7c

4、ycle=128AmpliconNo.ofCyclesNo.AmpliconCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,824DNA的制备疟疾DNA样本的准备和保存：抗凝血：全血，短期内存放于4℃，长期存放于-20℃。滤纸血：滤纸血样（3-4个血滴）置于封口袋中，短期内存放于4℃，长期存放于-20℃。DNA的制备与保存：参照说明书步骤进行抗凝血或滤纸血DNA的提取，常用QIAampDNABloodMiniKit。DNA长期应于-20℃冷冻保存。11DNA的制备DNA提

5、取中所需试剂、仪器和设备：DNA提取试剂盒无水乙醇离心机恒温水浴锅其他耗材12PCR反应13PCR标准反应体系DNA模板引物dNTPTaqDNA聚合酶Mg2+ddH2OPCRMix反应缓冲液PCR引物设计原则1、引物长度一般为15~30个核苷酸2、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。尤其是引物的3′端不应有连续3个G和C。否则会使引物在模板的G+C富集序列区错误配对。3、引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3′端的互补重叠。5、引物的碱基序列不应与

6、非扩增区域有同源性。6、引物3′端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3′端的最佳碱基选择是G和C。7、引物的5′端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子等。PCR反应PCR反应体系：总体积通常为20-50l。（1）模板DNA浓度一般为100ng/100L，模板浓度过高会导致反应的非特异性增加；（2）引物浓度为0.1-0.5mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降；（3）TaqDNA聚合酶浓度为0.5-2.5U/

7、50l，酶量增加使反应特异性下降，而酶量过少影响反应产量。（4）dNTP浓度取决于扩增片段的长度。一般情况下四种dNTP浓度相等，浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量；（5）Mg2+浓度为0.5mmol/L-2.5mmol/L，它是DNA聚合酶的激活剂，Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降，Mg2+浓度过高影响反应特异性。14PCR反应PCR循环参数：（1）变性：92℃~96℃，30s~60s；（2）退火：退火温度由引物长度和GC含量决定，一般在37℃~65℃，30s~60s。（3）延伸：70

8、-75℃，一般为72℃，时间为1min~2min。（4）循环次数：主要取决于模版DNA的浓度，一般为25-35次。次数过多则扩增效率降低，错误掺入率增加。15PCR反应经典循环参数（500bp以内）。94℃5min94℃30s55℃45s×30次72℃1min72℃7min1