疟疾快速诊断技术

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1、疟疾快速诊断技术的研究与应用湖北CDC传染病所袁方玉主要内容前言显微镜镜检用于疟疾诊断荧光显微镜用于疟疾诊断PCR方法用于疟疾诊断免疫学用于疟疾诊断1、疟疾诊断试剂基于的靶抗原2、诊断试剂基于的免疫学原理3、疟疾诊断的快速诊断试剂前言疟疾是广泛分布于热带、亚热带及温带边缘地区的一种重要蚊媒传染病，弓l起世界范围内的较高的发病率和死亡率，简便、快速和可靠的检测手段对提高临床疗效和控制流行具有重要意义。传统的厚、薄血膜姬氏染色镜检浩仍是当前疟疾诊断的主要方法，但费时费力，需专业培训人员，且对低原虫血症者易漏诊这些不足促进了更敏感、简便，更快速的新技术的发展

2、，如荧光染色镜检组氨酸富集蛋白和疟原虫乳酸脱氢酶抗原检测及PCR技术等。世界卫生组织召开的专家研讨会上认为疟疾的诊断方法应准确、敏感、低廉快速方法应能检出每微升100个原虫，检测时间应在1小时内完成检测。一、显微镜镜检用于疟疾诊断显微镜镜检仍是目前广泛应用的疟疾诊断技术(金标准）主要优点-特异高-能区分虫种-能分期-能计数-1小时内能完成诊断程序缺点要求有较高的技术素质容易漏检（恶性疟）大规模镜检费时、费力敏感性低（原虫感染率为0.01%，厚片的敏感性是薄片的10倍）二、荧光显微镜用于疟疾诊断研究发现，一些荧光素对核酸有好的亲和力，经一定波长的紫外线激活

3、，原虫核酸可通过荧光显微镜观察到。目前常用的荧光染色剂:有吖啶橙（AO）苯并硫羟基嘌呤（bcp）若丹明-123一种红色的荧光染料，主要作用于细胞膜，也常用于原虫染色FIG.1.TrophozoitesofP.falciparumstainedwithAOintheQBCUVfluorescencemethod吖啶橙（AO）优缺点：染色需要较高的技术，辨认非特异性着色因子，特别注意区分豪厄尔斯氏体同原虫的区别，这种豪厄尔斯氏体来自溶血性贫血的病人。一般来说，吖啶橙染色法检测原虫的敏感性为41-93%,为﹥100原虫/1微升血液,相当于0.002%感染率。检

4、测恶性疟的特异性为93%。检测间日疟和其他非恶性疟原虫的后期原虫的特异性只有52%。ｂｃｐ染色优缺点：ｂｃｐ染色后疟原虫厚血膜在４００倍荧光显微镜下见，疟原虫各发育期及滋养体、裂殖体和配子体呈特异性苹果绿色荧光；胞桨疟色素呈黄色；白细胞胞桨染成亮绿色。血膜中的异物不呈荧光色，易区别。FIG.2.TrophozoitesofP.falciparumstainedwithBCPinthefluorescencemethod.ｂｃｐ染色恶性疟与间日疟血片，敏感性为９７．４％、９１．２％，特异性为６６．７％、５０％，阳性预测值９７．６％、８８．６％阴性预测值５０

5、％与４０％。认为ｂｃｐ染色法是一种有使用价值的疟疾诊断新方法。若丹明-123：一种红色的荧光染料，主要作用于细胞膜，也常用于原虫染色，目前用得不多。三、PCR方法用于疟疾诊断PCR方法严格来说不能算是疟疾的快速诊断方法，他的主要特点是敏感性高，能检出每微升少于5个原虫的血液样本。复式、多层和荧光定量PCR方法可用于疟疾的定性和定量诊断，这对哪些形态学难以鉴别的样本来说非常有价值。（一）疟原虫检测的常用的分子标志有环子孢子(CS)、18SrRNA片段、裂殖子表面蛋白一1(Msp一1)、裂殖子表面蛋白一2(Msp一2)及富组氨酸蛋白(m)基因等CS是疟原虫子

6、孢子表达的一种期特异性表面抗原的基因。已发现通过测定CS基因序列的重复结构可进行疟原虫分类．了解其遗传特征和地理来源。自1984对CSP基因序列进行测定以来，已积累了大量CSP基因资料，至今为止有中美洲、南美洲、东亚、东南亚、南太平洋岛屿开展间日疟原虫CSP基因序列分析．问日疟原虫CSP中央重复区由15—21个9肽重复单位组成，每单位由27个核苷酸编码9个氨基酸，目前已发现两类明显不同的9肽重复单位，分为Pv—I型和PV一Ⅱ型．I型按9肽单位氨基酸序列变化分为温带族和热带族，两族序列差异明显．分布有一定局限性。（二）优缺点：PCR方法也可用于研究原虫的种

7、群差异、突变和对药物的抗性敏感性高。能够检测到感染率为0.00001%的恶性疟原虫血样，以及感染率为0.0000126%的间日疟血样。利用套式和逆转录PCR方法能鉴定4种疟原虫，一般PCR方法也存在着产物的污染易致假阳性，不能在一次检测中鉴别虫种，也不能诊断混合感染。需特殊设备，不能用于现场费时，成本高四、免疫色谱方法（一）原理免疫色谱技术其原理为利用硝酸纤维素膜(NC)制备免疫层析测试条，在NC上包被被检抗原的一株单抗作为捕获带，同时，将另一株单抗偶联在胶体金或乳胶上作为检测试剂。当样本溶液和检测试剂通过捕获带时，二者形成的复合物即被包被在膜上的抗体捕

8、捉，如果样品中含有被检抗原，则捕获带可发生颜色反应，颜色反应的强弱与样本中的抗原