定量PCR基本原理.pdf

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1、Module1：实时荧光定量PCR技术原理陈涛FieldApplicationScientistTel:8008208982/4008208982Theworldleaderinservingscience1什么是实时荧光定量PCR?•一种实时监控核酸扩增的技术在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。2定量PCR如何工作?•PCR反应液加入了各种类型的荧光标记物一个PCR循环3定量PCR如何工作?•在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而

2、增强PCRPCRPCR产物大量PCR产物4定量PCR仪如何工作?•所有的定量PCR仪器都有三个共同的组成部分2.光路系统3.检测器1.热循环模块5定量PCR如何工作?•每个循环结束后,定量PCR仪器通过光学系统记录荧光信号的增加循环1滤光片A样品1Level:6定量PCR如何工作?•最后,定量PCR软件计算出数据，用于实验结果的分析7定量PCR的数学原理8PCR动力学曲线和四个阶段平台期线性增长期指数增长期基线期对数图谱线性图谱9指数增长期内扩增曲线具有高度重复性96次重复可变的平台期荧光信号指数增长期内重

3、复性好循环数10定量PCR扩增曲线的各种概念Ct值nR∆阈值线基线Cycles11什么是基线？•基线是扩增曲线的水平部分基线基线对数图谱线性图谱12基线扣除BeforesubtractionRnDRnAftersubtraction13什么是阈值？•阈值是一个荧光强度值，穿过阈值与X轴平行的直线称为阈值线阈值阈值线阈值阈值线对数图谱线性图谱14什么是Ct值？•Ct值是阈值线与扩增曲线的交点对应在X轴上的值CtCt对数图谱线性图谱15如何使用Ct值计算结果?绝对定量相对定量Ctvalues01234567Lo

4、gcopynumber16定量PCR的化学原理17两种化学方法TaqMan探针法染料法18TaqMan探针法•TaqMan水解探针：5′端荧光报告基团与靶基因特异性结合的序列3′端荧光淬灭基团报告基团淬灭基团19TaqMan水解探针作用机理•完整的探针：•切断的探针：检测不到报告荧光检测到报告荧光激发光激发光能量荧光共振能量转移，FRET20变性(95ºC)21退火(60ºC)222324252627?285′-3′外切酶活性水解探针，使报告基团和淬灭基团分离2930313233343536373839

5、404142434445464748Burp!49实时记录每个循环后荧光信号的变化荧光循环数50荧光标记组合报告荧光:6-FAM、JOE、VIC、NED、CY3、TexasRed、CY5淬灭荧光:MGB-NFQ、TAMRA、BHQ参比荧光:ROX常用的荧光组合：FAM目的基因1VIC目的基因2/内对照NED目的基因3ROX参比荧光51荧光染料组合•StepOne™实时荧光定量PCR系统ChannelDyeExamplesExcitationWaveLenthghEmissionWaveLenthgh1FAM

6、™,SYBR®455~485nm~5202VIC®,JOE™510~530nm~5503ROX™,TexasRed®570~590nm~620•StepOnePlus™实时荧光定量PCR系统ChannelDyeExamplesExcitationWaveLenthghEmissionWaveLenthgh1FAM™,SYBR®455~485nm~5202VIC®,JOE™510~530nm~5503NED™，TAMRA™540~550nm~5804ROX™,TexasRed®570~590nm~62052荧

7、光染料组合•7500实时荧光定量PCR系统ChannelDyeExamplesExcitationWaveLenthghEmissionWaveLenthgh1FAM™,SYBR®455~485nm~5202VIC®,JOE™510~530nm~5503NED™,Cy3，TAMRA™540~550nm~5804ROX™,TexasRed®570~590nm~6105CY5Dye™630~650nm~650•ViiA™7实时荧光定量PCR系统ChannelDyeExamplesExcitationWaveLe

8、nthghEmissionWaveLenthghFAM™,SYBR®,SYTO®9(MeltDoctor™),1455~485nm~520nmFluorescein,SYPRO®Orange2VIC®,JOE™,TET™,HEX™510~530nm~550nm3NED™,BODIPY®TMR-X，TAMRA™540~550nm~580nm4ROX™,TexasRed®570~590nm~620nm5LIZ™630