调控ectB基因和培养条件对Paenibacillus polymyxa产多粘菌素的影响.pdf

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5、研究构建多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)重组菌株P.polymyxa1-8/pMD516-ectB，研究了调控ectB基因拷贝数对P.polymyxa1-8发酵产多粘菌素产量的影响。通过单因子实验、Plackett-Burman实验、最陡爬坡实验和响应面实验相结合，对P.polymyxa1-8菌株产多粘菌素培养基进行优化。最后，在摇瓶水平研究了pH值、溶氧、温度、以及接种量对P.polymyxa1-8菌株发酵产多粘菌素的影响。根据摇瓶实验结果，在5L发酵罐水平提出并尝试了多种发酵调控策略。主要研究内容和结果如下：(1)根据GenBank中

6、P.polymyxaectB基因序列，设计合成了两条引物，PCR扩增ectB基因，用XhoI和EcoRI双酶切PCR产物及质粒pMD516，并用连接酶连接，构建重组质粒pMD516-ectB。将重组质粒pMD516-ectB及质粒pMD516电转入P.polymyxa1-8中，得到工程菌株P.polymyxa1-8/pMD516-ectB和菌株P.polymyxa1-8/pMD516。对比两个菌种产多粘菌素的单位效价，对照菌P.polymyxa1-8/pMD516为3.61万U/mL，而重组菌P.polymyxa1-8/pMD516-ectB仅为2.86万U/mL。

7、结果表明，ectB基因拷贝数增加没有能够提高P.polymyxa1-8多粘菌素的发酵产量，且降低了P.polymyxa1-8发酵产多粘菌素的水平。(2)采用摇瓶培养，优化发酵培养基。通过单因子实验，筛选出可溶性淀粉为最适碳源，硫酸锌为最适无机盐。采用PB设计实验，筛选出有机氮源，无机氮源和碳酸钙为重要因子。通过最陡爬坡实验确定响应面实验的中心点分别为，大豆粕合大豆粉混合物48g/L、硫酸铵29g/L、碳酸钙8g/L。采用Box-Behnken设计实验，预测培养基配方为：可溶性淀粉25g/L、大豆粕合大豆粉混合物51g/L、硫酸铵29.3g/L、硫酸锌0.1g/L