hemH-lba基因表达调控对莱茵衣藻cc124生长和产氢的影响.pdf

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1、MasterDissertationTheimDactofexDressionre2ulationof厅P"z阻场口on2rowthlnelmDaCt0IeXDreSSlonre2UIanon0I尼P刀纠曙一fD口0ngr0Wtnandhydrogenproduction0fC讫缸厅纱如小D刀嬲化伽^口耐绒ccl24FengYingDirectedbyProf．WangQuanxiAssociatePro￡WuShuangxiuCollege0fLifeandEnVironmentSciences，ShanghaiNor

2、malUniVersi毋April2013摘要上海师范大学硕士学位论文论文题目：抛坍麒，6口基因表达调控对莱茵衣藻ccl24生长和产氢的影响学科专业：水生生物学学位申请人：冯盈指导教师：王全喜教授吴双秀副教授莱茵衣藻(劬肠叼砌聊D门傩陀加办撇ff)结构简单，生长速度快，培养容易且成本较低，遗传学背景清晰，分子操作容易，尤其是其氢化酶(hydrogenaSe，H2aSe)活性高，在无氧条件下，能利用太阳能把细胞内有机物分解产生的旷和e。或者光合作用过程中产生的旷和e‘合成H2并释放到细胞外，被认为是目前具有极大开发潜力的生

3、物制氢的模式物种。但是，莱茵衣藻的氢化酶对氧气特别敏感，而氧气又是光合作用的产物，所以在产氢的过程中，氢化酶很容易受氧气抑制而失活，这是衣藻产氢技术应用的最大障碍。因此，为了提高产氢效率，就要降低衣藻细胞内的氧气含量，保证氢化酶的活性。目前最常用的办法是去除培养基中的硫元素或加入某些抑制剂来抑制光系统II的活性，以减少光合作用产生的氧气量，但是同时也会降低光解水产生的电子量，使光合产氢的电子来源减少，导致产氢量降低。因此，如何既降低细胞内的氧气含量、又不影响电子的供应，是提高莱茵衣藻产氢的关键问题。豆血红蛋白(1e曲em

4、oglobin，Lb)与氧气具有很高的亲和力和快速的氧周转率，能帮助降低根瘤细胞内的氧气浓度和保证同样对氧敏感的固氮酶的活性。本实验室前期工作已经尝试将办e研厚场口(亚铁螯合酶基因JlzP聊肛球蛋白基因Z6口)转入莱茵衣藻的叶绿体中表达，使产氢量比对照藻849提高了约3．0倍，并通过密码子优化的方法提高了厅PmH肠口基因表达量，进一步使产氢量提高了约50％。本研究进一步通过调控办g朋H和舾口基因终止子的有无和转入不同的莱茵衣藻藻株来研究加聊麒，6口基因表达对衣藻产氢和生长的影响。通过将密码子优化后的办P脚厚，6口基因(即

5、抛聊崩口．Z6口c基因)和去掉办P聊正比基因和，6口c基因终止子的办P聊上配．Z6口c基因(命名为办P聊矗e．Z6口c埘)分别利用基因枪法转入具细胞壁的莱茵衣藻藻种ccl24(以下简称对照藻124)的叶绿体中，比较不同施聊胁．Z6口c基因结构的表达对对照藻ccl24生长和产氢的影响，主要研究内容和结果如下：上海师范大学硕士学位论文摘要(1)将去掉办P珑胁和，6口c基因终止子的办Pm胁．，6口基因合成后，成功构建了表达载体c9401．1-hemHc．1baC．M(将含未去掉终止子的加脚胁-舾口c基因的表达载体命名为c940

6、1-1-heInHc—lbac)。舢舢圳圳Ⅲ删舢哪舢ⅧfY2283899(2)利用基因枪法将载体c9401—1-hemHc—lbac和c酣01—1-hemHc-lbac-M分另1J转入到对照藻124的叶绿体中，经抗生素——壮观霉素(spectinomycin)筛选以及固体．液体反复继代培养，成功获得转基因藻株ccl24-hemHc．1bac和ccl24-hemHc．1bac．M。(3)通过PCR和RT-PCR方法对转基因藻ccl24-hemHc．1bac和ccl24．hemHc．1baC．M进行DNA和I矾A水平的检测，

7、PCR结果证实乃P聊觑7．舾口c及办Pm胁．，6口c．M基因片段己异质化整合到衣藻转化子的叶绿体基因组中，ImPCR结果表明办e朋j托．肠口c及办e历届P．舾口c—M基因在转基因衣藻的叶绿体中得到成功转录。“)对对照藻124和转基因藻ccl24-hemHc．1bac、ccl24-hemHc．1bac．M的生长情况进行检测表明：OD750值均在培养的第四天达到最大，转基因衣藻ccl24．hemHc．1baC．M和ccl24-hemHc．1bac的OD750值最高分别达到约3．65和2．80，对照藻124的OD750值最大约

8、为3．85；相应的细胞数也在第四～五天达到最大，分别为大约2．16×107个／InL，1．35×107个／mL和2．07×107个／mL；相应的叶绿素含量均在第五天达到饱和，分别为39mg／L，31mg／L和4lmg／L。此结果表明，转基因衣藻ccl24．hemHc．1bac．M的生长未受明显抑制，而转基因藻ccl2