莱茵衣藻产氢.ppt

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1、衣藻叶绿体中表达豆血红蛋白lba基因对其产氢影响的初步研究成珍豆血红蛋白存在于大豆根瘤中的根瘤菌(以类菌体的形式存在)的固氮酶对氧十分敏感，必须在兼氧的条件下才有固氮的活性，在高氧或者无氧的环境中是没有活性的.但是存在于根瘤菌周围的豆血红蛋白可与氧进行可逆性结合，在类菌体的周围起氧缓冲的作用，成为阻止过多的游离氧接触固氮酶的屏障，豆血红蛋白还作为氧的载体，负担着在低氧环境中为类菌体呼吸提供氧的任务，使固氮酶免受氧的损害，保持高效的固氮活性。因此本研究将豆血红蛋白转入衣藻叶绿体中表达，利用豆血红蛋白与氧气可逆结合的性质，尝试在衣藻叶绿体中模

2、拟大豆根瘤细胞的环境，创造一个低氧气环境的同时，结合部分抑制PSII活性的措施；提高光合电子传递效率，提高衣藻产氢效率。衣藻叶绿体外源基因的转化原理外源基因转化入衣藻叶绿体时是通过同源重组方式——即靠基因的同源片段的双交换方式定点将外源基因置换到衣藻叶绿体上。在构建叶绿体表达载体时，外源基因表达盒的前后分别连接有衣藻叶绿体基因组的同源片断，当载体进入叶绿体后，同源片断与受体基因组相应的片断发生同源重组，外源基因被整合到叶绿体的特定位点，随叶绿体基因复制和遗传，可以消除核转化的“位置效应”造成对基因表达的不利影响，实现高效表达衣藻叶绿体外源

3、基因转化的方法莱茵衣藻叶绿体转化的方法主要有基因枪法和电击法。基因枪法又称高速微粒轰击法，是在真空室中利用基因枪传递的高压氦气加速包被着DNA片断的金属微粒(金粉或钨粉)轰击受体细胞，这种方法转化效率高、重复性好、操作简便、适用于各种细胞类型，因而可用于衣藻的核转化、叶绿体转化和线粒体转化。电击法又称电脉冲法，是利用脉冲电场瞬间作用改变细胞膜的状态和通透性，形成可逆的瞬间通道，外源DNA通过通道进入细胞。该法操作简单快速、转化效率高、无菌操作容易控制，也常常用于细菌和高等植物的转化，转化效率同玻璃珠法相似。实验方法豆血红蛋白基因的克隆①大

4、豆总RNA的提取称取大豆成熟的根瘤o．1g，液氮研磨，抽提大豆的总RNA②RNA浓度和纯度的检测将总RNA稀释50倍左右，用紫外分光光度计(Eppendorf@BioPhotometer)读取)OD260和OD280值，计算RNA浓度和纯度。⑤豆血红蛋白基因lba-cDNA、Ibc1-cDNA、Ibc2-cDNA、Flbr-cDNA的克隆(1)根据NCBI发表的lba基因序列(V00453／J01299)、lbc1-cDNA基因序列(V00452／J01300)、lbc2-cDNA基因序列(V00452／J01301)、1)、Flbr-c

5、DNA基因序列($70187)的序列分别设计相应的特异性引物(2)PCR反应体系：根据以上lba、lbc1，lbc2、Flbr的cDNA序列所设计的特异性引物(合成引物加适量的ddH20溶解，使其终浓度为10umol／L)以Soybean总eDNA为模板，利用常规PCR技术分别扩增出Iba-cDNA、Ibc1-cDNA、Ibc2-cDNA、Flbr-cDNA的基因片段。(3)PCR反应条件：94℃预变性5min，一个循环；94℃变性1min，62℃(1ba,lbc1,lbc2)、退火3.0s，72℃延伸lmin；30个循环；72℃延伸10

6、min，PCR产物4℃保存备用。(4)PCR产物的鉴定：用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA的大小。如果大小正确,则将PCR产物纯化后连接到通用载体pEGM—Easy—TVector(Promega)(以下简称Tvector)‘上，再送测序公司检测PCR产物碱基序列的正确性。(5)PCR产物的纯化：DNA胶回收(TakaraAgaroseGelDNAPurificationkit)：电泳结束后，切下含目的片段的琼脂糖凝胶块，放入1．5ml离心管中，加入3倍体积BindingBuffer，5℃水浴10min直至彻底融化；将融化的胶溶液转移到柱中

7、，室温放置2min，8000r／min离心lmin，弃收集管中的废液；取下UNIQ-10柱子，倒掉收集管中的废液，将柱子放入同一个收集管中，加入500ul‘WashSolution，8000‘r／min离心1min；重复清洗二次(重复步骤5)后将UNIQ-10柱子放入一新的1．5ml的离心管中，在柱子膜中央加30uLElutionBuffer(PH>7)，室温放置2min12000r／min离心1min，离心管中液体即为回收的DNA片段，可立即使用或．20℃冷藏备用。载体的构建质粒DNA的制备(碱裂解法小量制备质粒DNA)收集培养过夜至对

8、数生长后期的菌液，用STE缓冲液洗去培养基；菌体悬浮于预冷的溶液I，激烈振荡，．使细胞完全分散：冰浴，加入新鲜配制的溶液lI，快速颠倒离心管几次，使内容物充分混匀；冰浴，加入预冷的溶液III颠