莱茵衣藻“细菌型”pepc2基因叶绿体表达及其对油脂蛋白质含量的影响.pdf

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1、第26卷第5期2017年9月上海海洋大学学报JOURNALOFSHANGHAIOCEANUNIVERSl7IYV01．26．No．5Sep．，2017文章编号：1674-5566(2017)05-0641—10DOI：10．12024／jsou．20161201915莱茵衣藻“细菌型"pepc2基因叶绿体表达及其对油脂蛋白质含量的影响冯思豫1，施定基1’2，贾晓会1，朱嘉诚1，米华玲3，贾睿1，何培民1(I．上海海洋大学水产与生命学院，上海201306；2．中国科学院植物研究所，北京100093；3．中国科学院上海生命科学

2、研究院植物生理生态研究所，上海200032)摘要：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvatecarboxylase，PEPC，EC4．1．1．31)在植物碳代谢中有重要作用，高等植物中PEPC可以调控蛋白质和脂肪酸含量，但是对绿藻PEPC的研究还较少。莱茵衣藻是绿藻中的模式生物，其基因工程中外源基因的转化以叶绿体转化效率最高，为了提高外源蛋白表达和获得高产油莱茵衣藻，利用叶绿体转化法能进一步提高表达效率。因此，本研究首先克隆了莱茵衣藻“细菌型”PEPCCSI(conservedsequenceI)的63

3、9bp，构建了pASapI-reve—Crpepc2和pASapI·forw—Crpepc2正反向叶绿体表达载体，并用基因枪法转化莱茵衣藻cc-400获得了空质粒型，正向型和反向型转基因藻株。其次，应用RT—qPCR方法检测Crpepc2的相对表达量，结果表明反向型Crpepc2的表达量减少了89．97％，而正向型增加了201．16％。最后，检测了总蛋白和脂质含量的变化，正向型突变株的总蛋白增加了37．03％；而反向型突变株的脂质含量增加了70．32％，且不饱和脂肪酸含量明显增加。以上结果证明莱茵衣藻“细菌型”PEPC的叶

4、绿体表达不仅可以进一步提高蛋白质与脂肪酸含量，也可为今后外源蛋白的表达和高产油工程藻的应用做贡献。关键词：莱茵衣藻；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)；叶绿体表达；RT—qPCR；脂肪酸；蛋白质中图分类号：Q785文献标志码：A磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)广泛存在于C3、C4、景天科(CAM)植物、真核藻、蓝藻、细菌、古生菌中，但不存在于动物和真菌中⋯。PEPC在植物碳代谢中起重要作用，在辅因子HC03’和M矿+协同下，可以催化PEP发生不可逆的B-羧化反应，生成无机磷酸(Pi)和草酰乙酸(OAA)[2J。2003年

5、，对pepc基因的研究有了突破性的进展，研究者发现PEPC有两种类型，其中一种pepc基因与细菌有高度的相似性，被称为细菌型PEPC(BTPC)，另一种存在于c3，C4，CAM植物中的PEPCs被划分为植物型PEPC(PTPC)‘3

6、。目前为止，PEPC的研究已经进行了十几年，且大多数研究集中于高等植物，尽管从1996年开始，一些绿藻的PEPC已经被证实M刁J，但对于绿藻PEPC的研究还较少，尤其是BTPC的研究。莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是一种单细胞绿藻，其结构简单，易培养、生长快，且对

7、其遗传和转化机制研究比较清楚"J，用它来探索细菌型PEPC更具优势。自2005年以来，对莱茵衣藻PEPC(CrPEPC)的研究有了一系列有意义的发现。MAMEDOV等发现莱茵衣藻的植物型PEPC是由pepcl基因编码，而细菌型PEPC是由pepc2基因编码的，不仅如此，Crpepc2比Crpepcl结构更复杂，并且催化活性更强，对PEP有更高亲和力一d1

8、。侯李君等通过抑制大肠杆菌PEPC酶的表达，获得了含油量更高的工程菌株¨2

9、，贾晓会等用反义RNA法抑制pepc表达，获得了高产油工程蓝藻013]，DENG等已经证明莱茵

10、衣藻pepc基因的表达跟油脂含量呈负相关‘14。5

11、。收稿日期：2016．12—05修回日期：2017—05．12基金项目：国家高技术研究发展计划(2009AA064401)作者简介：冯思豫(1993一)，女，硕士研究生，研究方向莱茵衣藻生理、生化。E-mail：806694095@qq．com通信作者：何培民，E—marl：pmhe@shou．edu．cn642上海海洋大学学报26卷已经有科学家对莱茵衣藻pepc基因的核表达进行了研究，也取得了一些结果，但外源基因导人衣藻后较难获得稳定有效的表达，外源基因会出现“基因沉默

12、”问题，或是在基因、蛋白水平受到阻遏，所以寻找一种更好的表达方式是必要的。莱茵衣藻是至今唯一可成功进行叶绿体、线粒体和细胞核3套基因组转化的绿藻，虽然衣藻叶绿体转化起步比细胞核晚，但在构建叶绿体表达载体时，外源基因表达盒的前后分别连接着衣藻叶绿体基因组的同源片断，当载体进入叶绿体后，同源片断与受体基因组