细胞培养实验课程.doc

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1、实验一传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养一、实验目的了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。二、常用细胞的种类BHK-21：仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2：猪肾传代细胞Hela：人的子宫瘤细胞Vero：非洲绿猴肾细胞Marc-145:来源于Vero细胞Sf9：昆虫细胞三、材料1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头2、BIIK-21（babyhamsterkidney）细胞3、0.25%胰酶4、牛长液：含10

2、%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉索的DMEM四、传代细胞培养的条件要求1）细胞密度：2-3X105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4,耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37°C昆虫细胞28-30°C五、常用细胞分散剂与作用原理1、朕酶使精氨酸或赖氨酸的竣基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发牛水解,导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。3、灰色链丝菌卿:由灰色

3、链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白稱、氨肽1W和竣肽酶的混合物。六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维牛素、辅酶、瞟吟、卩斛定、辅助牛长因子。2、血清1）血清的种类胎牛血清、新牛犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其屮以新牛犊牛血清使用最为广泛。2）血清的处理无菌采集，过滤除菌。用前56°C灭活补体30mino七、传代细胞系培养1、优点：1)2)3)可以无限的传代。不少细胞系对病毒很敏感。2、3、1)2)牛长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。缺点：在传代过程屮遭到支原体和病毒的污染。培养方法取

4、长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。加入2ml胰酶消化液，于37°C培养箱放置儿分钟，至细胞间出现空隙或细胞4)某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量牛变圆后，倒去消化液。3）加入牛长液,反复吹打儿次，使细胞分散成单个细胞，然后分装于3个小瓶屮。再在每个小瓶屮补充牛长液至10ml,然后置37°C培养箱培养，培养1-2天即可长成单层。八、病毒（PRV）在传代细胞中的培养1、选长满单层的细胞，倒掉培养液。2、加入适量的病毒悬液3、置温箱中感作（吸附）45min-lho4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培养液，补足维持液，置温箱屮

5、继续培养，直至80%以上的细胞病变。5、收毒：将病变的细胞置于-20C冰箱屮，冻结后取出口然解冻，在解冻过程屮振摇几次，以使细胞完全从瓶壁上脱落。然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器•1*0低温贮藏备用。实验二、原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）、实验目的了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养方法。二、材料1、9-11日龄鸡胚2、照蛋灯与蛋座3＞碘酊棉球与酒精棉球4、大剪子、眼科剪、小蹑子5、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶、6、胰酶、牛长液、维持液三、细胞培养的条件要求1）细胞密度原代细胞:4-6X105个/ml

6、传代细胞：2-3X105个/ml2）pH范围最适pH7.0-7.4,耐受pH6.6-7.83）培养温度哺乳动物细胞一般为37°C昆虫细胞28-30°CU!1、取9-12口龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。2、无菌操作下用剪子去除气室部卵壳，去除壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿屮。3、用眼科剪、银去除鸡胚头、四肢及内脏，用DMEM冲冼2次。4、将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。5、将剪碎的组织块倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶屮，用DMEM充分冲洗，并静置儿分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体

7、，再加DMEM。如此反复冲洗2-3遍。6、于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%腑酶,并调pH至7.6-7.8,振荡混匀后置37°C水浴屮感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次，使细胞消化完全（组织块变散松，沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。7、取出，静置几分钟，小心吸弃上层胰酶溶液，用DMEM轻洗2次后，加入牛长液5ml,用大口径吸管反复吹打，使细胞游离。8、静置几分钟，使未消化好的组织块下沉。9、细胞计数取细胞悬液0.5ml+2nil0.1%结晶紫一枸椽酸(0.lmol/L)溶液，室温或37°C温箱'p5-10min,充分振荡后进

8、行计数。按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数(N)。每ml悬液中的细胞数(n)=N/4X10000XK(稀释倍数)。活细胞数应在90%以上。10、将计数好的细胞稀释到合适的浓度，使细胞量约为4-6X10°个/ml,分层于细胞培养瓶中，每瓶l