自主实验动物细胞培养.doc

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1、实验名称:动物细胞培养（传代培养）组员:孙思邈，向飞，栾新梅，高原实验目的:掌握动物细胞培养（传代培养）的基木方法实验原理:细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养.使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或观料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无汕迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0.lu

2、g,也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的火菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被火菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤最大的培养用液常用较大型号的金属滤器（直径90mm、100mm、142mm……等）,配以过滤泵使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的卿.料小滤器（直径20mm.25mm等）。滤膜孔径有0.60um、0.45um、0.35u田、0.22um、0.lOum等，以0.2

3、2um除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的波膜。实验用品:离心管（2支），离心机，移液枪（一把），吸量管（2ml）,洗耳球，枪头（一盒）,吸管（4根），培养瓶（2个）超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，无臭氧型紫外灯，微孔滤膜（直径25）：孔径为0.22pm,微孔滤膜（直径90）：孔径为0.22Um,过滤器（直径25）,C02培养箱，耐酸手套（四副），洗涤剂,70%或75%酒精，重路酸钾，浓硫酸，0.25%胰酶,D-Hanks,1640培养基，牛胎血清，待传代的细胞，实验步骤:（一）清洗（1）用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。（2）浸酸性洗液过夜

4、。（3）从酸性洗液捞出后自来水冲洗10-15次去除残余酸液，蒸偏水涮洗3次，倒置烘干。（4）包装（牛皮纸或一般纸）。（5）高压（15磅20min）或干热（160°C2h）灭菌。（6）贮存备用。是硫酸…重铭酸钾溶液。洗液可根据需要配制成不同的强度（见下表）。常用的洗液配方成分强酸洗液次强酸洗液重铭酸钾浓硫酸（工业）63g1000mL3150g50000mL120g200mL6000g10000mL蒸偏水200mL10000mL1000mL50000mL配制方法：（1）将重铭酸钾放人大烧杯中，加入蒸馅水放在石棉网上加热至沸腾并搅拌，使重铭酸钾充分溶解。（2）将重铭酸钾液倒入酸缸中，然后

5、缓慢加入硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌，充分混合溶解。操作时务必注意安全，穿戴好耐酸手套和围裙，防止洗液溅到皮肤和衣物上。万一不慎溅到皮肤上应立即用大量清水冲洗。在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为0.22um用布包好，查看高压锅内的水是否充足，放入物品盖好盖加热高压锅。将放气阀打开，放气5—10min,以排除锅内的冷空气。待锅内水沸腾后，落下放气阀继续升温升压,玻璃器皿等用15磅（12rC）30min,胶塞、塑料制品、溶液等可用10磅（115笆）20min。调节火力大小保持该压力。（二）配置消化液胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用D-hanks配置。配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25%。用滤器过

6、滤除菌。（三）传代培养1.打开超净台，把实验中所需用具放到超净台上。2.用酒精将手和用具消毒3.从冰箱中取出0.25%胰酶、D—Hanks、培养基。可以把胰酶和D-Hanks的瓶盖打开或者拧松。4.取待传代的细胞，用尖吸管弃去旧的培养基，加入D-Hankso轻轻摇动后将Hanks奔掉。5.用尖吸管吸取适量胰蟾加入，加入的量以覆盖整个细胞培养面为宜，轻轻摇动。2—5分钟后迅速将消化液吸出。消化时I'可长短是实验成败的关键，宁可短消化，不能过消化。否则细胞会变死。在倒置显微镜下观察，当细胞质I可缩，胞间间隙加大为消化适宜。6.取培养基加入细胞，反复轻轻吹打培养皿壁，制备细胞细胞悬液。吹

7、打的部位均匀，从上到小，从左到右，顺序进行吹打，保证各个部位的培养细胞均能吹打到，成片的细胞已经分散成小的细胞团或者单细胞便停止吹打。吹打时用力不要过猛，尽量不要出现气泡，以免损伤细胞。7.至所有细胞从培养1111底部脱落下来，然后吸取至高心管中。1000rpm离心5分钟。（无需准确计数时离心可略）8.细胞离心毕，尖吸管弃去上清液，吸取培养基适量，加入离心管，将细胞重悬、吹匀。（无需准确计数时离心可略）1.吸量管吸取适量培养基1.5ml加入新的培养皿中。细胞悬液0.5