动物细胞培养技术实验教程内容.doc

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1、实验1细胞培养概述(一)细胞培养室的设置和无菌操作【实验原理】细胞培养技术与其他一般实验室T作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他何害因素的影响。一般标准的细胞培养室应包括配液室、准备室和培养室。三室既相互连接又相对独立,备自完成培养过程屮的不同操作。【实验目的】%1了解培养室的设置和设备。%1学习无菌概念和无菌操作要领。【操作步骤】1.实验室设置(1)配液室(2)准备室(3)培养室培养室内要完全密闭，保持恒定的温度，在设计上要注意以下几点：%1培养室的位置最好设在阴面，阳光不能肓接照射的地方，防止室内温度增高。%1天

2、花板的高度不要超过2米，以保证紫外灯的有效杀菌效应，%1门一般用拉门，以防止空气流动。%1天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角，要镶瓷砖或涂油漆，这样设计，一是便于淸洗和消毒，另外也不易在墙角堆积灰尘。2.实验室常用设备(1)准备室的设备%1双蒸馄水蒸幅器：制备双蒸水。%1酸缸：盛洗液，浸泡玻璃器具。%1干燥箱：洗涤完的玻璃器血用干燥箱烘干。%1高压锅：玻璃器皿、解剖用具、部分液体、艰料器具等火菌。不同物品其有效火菌压力和时间不同。%1储品柜1：放置未消毒物品。%1储品柜2：放置己消毒物品。准备室注意事项：%1预防熬憎器被烤干。%1

3、勿将酸液溅到衣物或地面。%1勿将高压锅排气阀和安全阀堵塞。%1已消毒物品应与未消毒物品分柜存放。（2）配液室的设备%1天平（扭力天平和电子天平）：称量用%1pH计。%1磁力搅拌器。（3）细胞培养室的设备%1超净工作台：超净T作台的种类很多，有单面单人、单面双人、双面双人或双面四人等，其T作原理是利用鼓风机，使通过高效滤气的空气，徐徐通过台血，这样使T作环境中具无菌而均匀的空气。根据层流方式的不同，超净工作台主要分为水平层流式和垂直层流式两种，基木原理大致相同，都是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器，

4、由此送出的洁净气流从一定的均匀的断面风速通过无菌，从而形成无尘无菌的高洁净度T作环境。但两种净化台的气流方向不同。第滤板飲风机-SIOA外流式BM诜式使用超净工作台应注意的几点问题：A.净化工作台最好安装在无尘的房间内，最好为隔离好的无菌间内，以免尘土过多易使滤器阻塞，降低净化效果，缩短使用寿命。B.新安装的或长期未使用的T用台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，再采用药物火菌法或紫外线火菌法进行火菌处理。C.每次使用工作台时，应先用75%酒精擦洗台面，并提前以30~50min紫外线火菌灯处理

5、净化工作区内积累的微％物。在关闭紫外灯麻应启动送风机使之运转两分钟后再进行培养操作。D.净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流型不受干扰。E.一般情况下，高效过滤器三年更换一次。更换高效滤器应请专业人员操作，以保持密封良好。要定期将粗过滤器屮的过布（无纺布）拆下清洗，时间应根据环境洁净稈度而定，通常间隔3〜6个月进行一次。A.每次使用净化台要及时清除工作台面上的物品，并用洒精擦洗台面使Z始终保持洁净。%14°C冰箱和低温冰箱：%1CO?培养箱：A.一定浓度的CO?对细胞生长，尤其是原代培养和单细胞培养有促进作用（5%）o

6、B.一定浓度的CO?可维持培养液恒定的pH。适用于开放培养，培养箱封口后，可在一般恒温培养箱内培养，但是采用培养血或多孔板培养时，贝帰要高湿度和高CO2含量的空气。C•它增加了湿度，箱体内装有水浴，可以保证培养箱内的湿度。D.培养箱内装有紫外灯。E.通过气体流量计可以调节CO?和空气的比例。F.在水屮可加入防腐剂（二氧乙酸）。可防止因CO?培养箱中湿度较高，易长霉菌。%1离心机：%1C02钢瓶：%1液氮罐：%1储品柜：用來存放杂物%1紫外灯：%1空气净化系统%1倒置显微镜1.无菌操作（1）无菌室的灭菌：%1紫外灯无人时就要打开；%

7、1进无菌室要穿无菌服、戴帽了和口罩；%1每周清洗消毒一次；%1所用物品要以外科手术方式严格消毒；%1室内台面要要保持洁净，做完实验后，用75%酒精或千分之三新洁尔火棉球擦拭超净T作台的台内、边台的台血、倒置显微镜的载物台等；%1所用物品要一次性准备好；%1瓶口要川酒精火焰消毒；%1尽量减少出入。（2）实验人员的无菌准备：%1肥皂洗手%1穿好隔离衣%1酒精棉球擦手【实验报告】逝岀一个标准细胞培养室的草图，标明备室的必须设备。【思考题】1.观看演示填写出无菌操作的要领。2.在无菌室工作时应注意的事项是什么？3.实验过稈屮如何才能在头脑

8、屮形成良好的无菌概念?(二)器械的清洗与消毒【实验原理】衣组织培养过程屮，离体细胞对任何毒性物质祁十分敏感。毒性物质包括解体的微生物及细胞残余物以及非营养的化学物质，因此对新采用和重新使用的培养皿等培养用品都要严格清洗和消毒。【实验目的】学习并掌握