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1、动物细胞培养技术实验实验十讥动物细胞培养技术及具应用%1.实验目的通过木实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。%1.实验内容1•培养基呢制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术；2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术；3.细胞污染检测方法与技术；4.病毒在细胞屮的感染与增殖、重组病毒异源蛋门的细胞表达等实用技术。三・实验用品1.材料：Sf细胞、Hi5细胞等2.器材：C02培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5ml和10
2、ml移液管、不锈钢移液管筒、人小不锈钢饭盒、洒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH试纸、酒精棉球等3.试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉索、链霉索）100u/niKHank,s液、胰蛋门酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、DNA提取试剂盒DNeasyBlood&Tissuekit（Qiagen）等。四.实验方法与步骤（一）培养基配制
3、、细胞培养、细胞冻存与复苏1.缓冲液及培养基配制Hank's液:KH2P040.06g,NaCl8.0g,NaHC030.35g,KC10.4g,葡萄糖1.Og,Na2HP04・H200.06g,加H20至1000ml,高压灭菌。4°C下保存。胰蛋门酶液：称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250）,加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank，s液溶解，滤器过滤除菌，4°C保存，用前可在37°C下冋温。4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100mloMTT溶液：MTT0.5克，溶于100ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank's液
4、中。4°C下保存。Grace培养基：取一份GIBCO公司的Grace培养基粉剂，按说明用量加入1000ml三蒸水100单位/毫升青、链霉索，充分混匀使溶解，调节pH值至6.8左右。0.22Um滤膜抽滤除菌，4°C下保存。此为基础培养基。使用前加入10%胎牛血清。细胞冻存液:基础培养基加入10%DSM0,20%胎牛血清,用前配制。PBS缓冲液:137rnmol/LNaCl,2.7mmol/LKC1,8.1mmol/LNa2HP04,1.5mmol/LKH2P04,pH7.0,121°C（15磅）消毒20mino弱硫酸洗液:重铭■酸钾10
5、g,粗浓硫酸200ml,水lOOmlo先称取粗制重锯酸钾10g,放于人烧杯内，加普通水100ml使重俗酸钾溶解（必要时可加热溶解）。再将粗制浓硫酸（200ml）缓缓沿边缘加入上述重锯酸钾溶液屮即成。加浓硫酸时须川玻璃棒不断搅拌，并注意防止液体外溢。若川瓷桶人量配制，注意瓷桶内而必须没有掉瓷，以免强酸烧坏瓷桶。配时切记，不能把水加于硫酸内（将因硫酸遇水瞬间产生人量的热量使水沸腾，体积膨胀而发生爆溅）。1.培养瓶等玻璃制品的清洗与消毒（1）细胞培养川玻璃制品的清洗包括-洗衣粉液浸泡、刷洗、自来水冲洗及酸泡等步骤。酸泡24小时后，用流水冲洗
6、将酸液完全清洗掉，然后川蒸溜水浸泡和冲洗数次，烘干备用。注意接触洗液时必须戴防酸手套以防护。（2）将培养瓶或移液管等分别放入消毒盒或筒中，1219（15磅）消毒30min,烘干后备用。1.细胞培养与传代（以昆虫细胞Tn-IIi5为例）在培养瓶屮细胞生长成单层，铺满瓶底时就需要传代了。传代步骤如下：（1）倒置显微镜下观察细胞形态和生长状态，确定细胞是否需要传代及细胞需要柿釋的倍数。（2）用0.1%新洁尔火溶液或70%酒精擦净超净台台血。打开超净台的紫外灯照射台面20亦门左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。（3）操作前
7、用肥皂洗于，用70%酒粘擦拭消离双手。（4）点燃酒精灯；将培养瓶瓶口用70%酒精消毒，过酒精灯火焰后放置于酒精灯旁。（5）在火焰周围打开培养瓶瓶盖，用无菌移液管按比例吸取5^10mLGrace完全培养基，小心吸打儿次，以将瓶底的细胞吹起混匀，再将细胞悬液均匀分装到新的培养瓶中。（6）对于贴壁很紧的细胞，先倒掉培养瓶小的旧培养基，再向培养瓶屮加入1mL胰酶，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收冋突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加
8、-定量的含血清的新鲜培养基（3〜5mL/小瓶）制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶小。（7）将传代细胞放到培养箱屮，28C培养。每隔24hr在倒置显微镜下观察，待细胞又长成单层时再次进行传代。2.细胞冻存（1）预先呢制冻存液
