实验 动物细胞培养基础实验技术

《实验 动物细胞培养基础实验技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、实验动物细胞培养基础实验技术——器械的清洗与消毒实验目的：学习并掌握细胞培养使用的器皿、器械的洗涤和消毒。实验用品：1．仪器和用品：超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器、紫外灯、0.22μm/0.45μm微孔滤膜。2．试剂：75%酒精、5%HCl、1‰新洁尔灭、重铬酸钾。实验内容：1．准备培养用血清瓶（PBS、培养基，约10套，包括20、50ml）、培养瓶（50个）、玻璃滴管（若干）、离心管（10ml）、EP管若干、不锈钢滤器、胶塞、滴头等。2．分别包装上述物品，其中血清瓶和瓶盖分别包装，玻璃吸管置于不锈钢筒中、玻璃离心管、EP管分别置于饭盒中。3．将上述物品置于高压

2、灭菌锅中进行消毒灭菌。4．实验室准备。实验步骤（一）清洗1．玻璃器皿的清洗浸泡刷洗浸酸冲洗（1）.新购玻璃血清瓶先用洗衣粉洗，再以0.1-0.05mol/lHCl浸泡数小时，然后用铬酸浸泡过夜，最后用自来水、一次与二次去离子水洗净后才能开始使用。（2）.用过之玻璃血清瓶，用洗衣粉洗净后铬酸浸泡过夜，最后用自来水、用一次与二次去离子水冲洗干净。此外，玻璃器皿的瓶子的盖子必须也泡铬酸，培养瓶瓶盖可以不用泡铬酸，高温灭菌的时候要拧上瓶盖，留有一定的缝隙，灭菌后盖紧。瓶盖的上面应当用锡箔纸或者牛皮纸包住，用绳子扎紧2．塑料器皿的清洗自来水充分浸泡冲洗2%NaOH浸泡过夜蒸馏

3、水漂洗3次2%-5%盐酸浸泡30min自来水冲洗晾干紫外线照射30min3．胶塞等橡胶类的清洗自来水冲洗2%NaOH煮沸15min自来水冲洗蒸馏水煮沸10min自来水冲洗5次以上2%-5%HCl煮沸15min晾干晾干后高压灭菌4．金属器械的清洗新购置的器械用过的器械（二）包装分为局部包装和全包装。为了防止消毒灭菌后再次遭受污染。按照不同类别进行包装。（三）消毒灭菌主要包括物理法和化学法。物理法：热灭菌、蒸汽灭菌、滤过除菌、紫外线、熏蒸消毒、煮沸消毒。化学法：应用化学制品进行消毒灭菌。（四）无菌室和操作野消毒无菌室内每周用乳酸蒸气（或过氧乙酸）加紫外线消毒1-2次。实

4、验前，将实验器材放入超净台内，打开超净台紫外灯，同时启动超净台风机，40min后消毒完毕，关闭紫外线灯。这样，超净台内空气被净化，超净台面构成相对无菌的环境。或无菌室：每周用75%酒精擦洗后紫外灭菌。实验培养基的配制及细胞培养的条件一、培养基的特性－细胞生存的环境与条件1温度条件（37＋0.5）2pH条件（7.2-7.4）3气体条件4水的质量（三蒸）5渗透压6营养条件7无菌条件℃二、 培养基的分类1平衡盐液2天然培养基（小牛血清、胚胎液）3合成培养基（化学成分清楚）三、 RPMI1640培养基的配制1、RPMI164010g2、丙酮酸钠0.11g3、Hepes（羟乙

5、基哌碃乙硫磺酸）5.925g4、NaHCO32g5、三蒸水1000mL四、 过滤出菌   仪器：不锈钢正压滤器   材料：纤维素微孔虑膜（0.22mm孔径）装好后消毒五、 完全培养基的配制RPMI1640培养液85mL小牛血清10mL谷氨酰氨1mL抗菌素（青、链霉素）1万单位1mL实验动物细胞连续传代培养（SP2/0细胞）一、实验目的：1、为细胞融合准备SP2/0小鼠骨髓瘤细胞；2、杂交瘤细胞的扩大培养（种腹水），或传代培养。二、实验原理：小鼠骨髓效力细胞株（NSI，SP2/0）和杂交瘤细胞均具有无限生长繁殖的能力，它们都属于半贴壁细胞，不用胰蛋白酶或EDTA消化液

6、，只需轻轻冲洗瓶壁上的细胞便可脱落。因而可以利用这些特性对这类细胞进行连续传代培养，以为实验提供生长旺盛的细胞（对数生长期的细胞）。三、实验材料：SP2/0细胞（或杂交瘤细胞）CO2培养箱、细胞培养瓶（25、50、100毫升）、弯头滴管、消毒用套筒（玻璃或铜质）、吸头、RPMI-1640完全培养基、倒置显微镜、试管架、酒精灯、灭菌高压锅。四、实验步骤：1、复苏的或转瓶的传代细胞，使细胞浓度大约为5×104/毫升，置37℃5%CO2培养箱中培养。2、培养48小时后，可见部分细胞贴壁生长，而部分细胞呈漂浮状态，可用滴管吸去漂浮的细胞，加入少量新鲜培养基继续培养24小时以

7、上。3、若细胞生长过密，则需及时冲下并吸出部分细胞，或将吸出的细胞转瓶扩大培养，如果不是这样处理，细胞很易出现衰老、死亡现象，对于杂交瘤来讲，这样更易诱发阳性克隆丢失可能性。4、用于细胞融合的骨髓细胞，必须在生长繁殖的对数期（约105细胞/毫升），而且细胞形态规则要一致（圆而亮，有一定的立体感），机能要活跃，活细胞数在90—95%以上。要得到这种细胞，其培养技巧在于，在融合前24小时，将生长良好的细胞全部自瓶壁冲下来，并除去1/2或更多的细胞，加入新鲜培养液令细胞重新贴壁分裂增繁。5、作为长期在体外传代培养的细胞，为减少工作量，可采用8—10%小牛血清的培养基，