细胞培养实验技巧

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1、中国农业大学国家动物原虫实验室细胞的生长方式及类型■贴附生长型细胞:贴附于底物表面生长的细胞。*上皮样细胞型…来源于外胚层和内胚层的细胞，形态为扁平的多角形，胞质近中央处有圆形的细胞核；细胞之间紧密相靠、相互衔接。*成纤维样细胞型…起源于中胚层的细胞，形态似在体内生长的成纤维细胞，有长短不等的细胞突起，多呈梭形、不规则三角形或扇形；漩涡、放射、栅栏状。*其他■悬浮生长型细胞细胞生长特点■贴附并伸展作用底物：其他细胞、胶原、玻璃、塑料等促细胞附着物：基膜素、血清扩散因子等影响因子：离子作用、机械物理作用■接触抑制正常的细胞不相互重叠生长，但肿瘤或转化细胞抑制下降■密度依赖性（密度抑制）细胞的生长

2、特点■原代培养…有限细胞系人胚成纤维约可培养50代；恒河猴皮肤成纤维>40代；鸡成纤维细胞少数克隆约30代；小鼠的约8代。■传代培养细胞・一来源特点种族组织形态学悬浮生长3T3鼠内皮应纤维细胞2N=40L鼠结缔纽织成纤维细胞能2N^40CHO中国仓鼠卵巢上皮细胞能2N=22HeLa人宫颈肿瘤上皮细胞能KB2N=46上皮细胞人鼻咽肿瘤能表1-2某些常用细胞系的特征细胞生长的条件■基本营养物质氨基酸、维生素、碳水化合物以及无机离子■促生长因子血清■温度35°C-37°C■气相5%CO2■PH7・2~7・4用磷酸盐缓冲剂■渗透压■无污染及无毒微生物污染，不同细胞的交叉污染细胞培养实验室的设置■无菌操

3、作区无菌操作室、超净工作台■孵育区C02培养箱■制」备区培养液及有关培养用液的制备。■彳诸存区取放方便，清洁，无灰尘细胞培养器皿的清洗1、玻璃器皿…干净，带适当电荷a.浸泡：新玻璃器皿表面呈碱性，用自来水初步刷洗，在5%的稀盐酸溶液中浸泡过夜；使用后的器皿立即浸入清水。b.刷洗：用软毛刷和优质洗涤剂C.浸泡：由浓硫酸200ml、重铮酸钾120g＞蒸惚永1000ml配置，由棕红色变为绿色时，表示水分增多或有有机溶剂，应废弃重新配置。d・冲洗:流水冲洗10次以上，再用蒸惚水洗2~3次。烤干备用。2■胶塞、盖子.针头的清洗胶塞、盖子用后及时浸泡，用洗涤剂刷洗；针头用自来水冲洗后，在2%NA0H中煮1

4、0-20min,冲洗干净后1%稀盐酸浸泡30min,冲洗。细胞系的复苏和培养■1.从低温冰箱中取出塑料冻存管。-2.迅速放入37°C水浴中，并不断摇动，使其急速融化，30s〜1min内完成。■3.冻存管用70%酒精棉球擦拭消毒后，打开上盖，用吸管将细胞悬液吸到离心管中。■4•低速离心(1000r/min)10min,去上清液。再用培养液洗一次。■5.沉淀加10毫升培养液，吹打均匀后再离心10min,弃上清液。■6.加适量培养基后将细胞转移至培养皿中，置37°C恒温箱中培养，第二天观察细胞生长情况。细胞的传代培养■1.在传代前，首先将培养瓶置相差显微镜下，观察细胞是否已长成致密单层■2.先将培养

5、液、胰酶、培养液放在37°C水浴中，然后用1%新洁尔灭浸泡消毒，再进入无菌室o■3.取将传代的细胞，弃去原培养液，加入0.25%胰蛋白酶1ml,置室温下作用2〜3分钟后翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，待细胞层出现缝隙，（空隙）时，即可停止消化。如未出现缝隙，可再将瓶翻回，让消化液继续浸泡几分钟之后再翻转培养瓶，直至出现缝隙，然后倒去消化液。也可以在显微镜下观察，当单层细胞变成圆形时，立即停止消化，慢慢弃去消化液。■4.加入3〜4ml培养液，即可终止剩余消化液屮胰蛋白酶的消化作用，用滴管轻轻将瓶壁上细胞吹打下來，打匀后分装2个培养瓶。■5.补加培养液，使每瓶中培养液仍为3〜5ml。置37°C恒温箱

6、中继续培养。注意事项：■1.实验之前将实验中用到的培养液及其他溶液先丁37°C温育一段时间。■2.向培养有细胞的培养瓶中加入液体时，一般沿着生k细胞的对面#瓦壁注入撚后慢慢转动培养瓶。■3.操作过程屮要尽量轻拿轻放。■4.酶解消化过程中要不断观察，消化过度会对细胞造成损害，消化不够则难于将细胞解离下来。细胞的冻存■1.选对数增生期细胞，在收集细胞24h前换液一次。■2.按传代方法把培养细胞制备成悬液，收集到离心管中，1000r/min离心10分钟，弃上清液。■3.沉淀加适量完全培养基，吹打均匀，计数，加入10%的DMSO,调整至5X106个细胞/ml左右。■4.将悬液分至冻存管中，每管1ml。

7、・务将冻存管空封严，贴上标签，写明细胞种类，冻存日■6・按下列顺序降温：室温一>4°C冰箱（20min）>20°C冰箱（30min）—>-80°C冰箱冻存。细胞培养常见问题与分析■1•冷冻管应如何解冻?■取出冷冻管后，须立即放入37°C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。■