2013《细胞培养》实验讲义

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1、《细胞培养》实验讲义实验一细胞培养室无菌环境的建立和实验器具的清洗、包装和灭菌一、原理：防止污染是决定细胞培养成功的首要条件。由于体外细胞缺乏抗感染能力，因此无菌技术在细胞培养中显得尤为重要。二、目的要求：通过实验，培养学生良好的卫生观念，确立细胞培养的无菌意识；掌握细胞培养室的消毒及灭菌方法；掌握培养用品的高温消毒方法。通过细胞培养室和主要设备的无菌环境建立，逐步掌握无菌操作概念。掌握细胞培养室、培养箱和超净台的消毒方法；掌握玻璃器皿、金属器械、橡胶制品的清洗、包装和灭菌方法。三、实验材料：细胞培养室环境、培养箱、超净台、边台、紫外线灯、70

2、％酒精等等；玻璃培养瓶、玻璃滴管、手术器械、圆筒、铝制饭盒等电动高压锅、烘干箱、超声洗涤机、酸液及酸缸、纯水仪等四、操作方法：1、环境消毒细胞培养室环境消毒用紫外线灯照射30～60分钟以上才能进入其内工作。培养箱箱体内壁和隔板可用70％酒精擦拭。超净台操作野主要用紫外线消毒。2、器械清洗（1）玻璃器皿的清洗：浸泡®刷洗®浸酸®冲洗（详见课件）（2）塑料器皿冲洗反复利用塑料器皿需经清水浸泡后流水冲洗；流水冲洗®晾干®2％氢氧化钠浸泡过夜®清水冲洗®2～5％盐酸浸泡30min®清水冲洗®蒸馏水漂洗3遍®晾干后包装，以备灭菌。（3）胶塞等橡胶类用品的

3、处理新胶塞（含有大量滑石粉）：用清水冲洗®2％NaOH煮沸15min®清水冲洗®2～5％盐酸煮沸15min®清水冲洗5次以上®蒸馏水漂洗5遍以上®蒸馏水煮沸10min®倒掉废水，余热烘干胶塞备用（或经101.3kPa高压灭菌）；旧胶塞：用清水浸泡®2％NaOH煮沸10～20min®清水冲洗®1％盐酸煮沸30min®清水和蒸馏水漂洗5遍以上®蒸馏水煮沸10min®倒掉废水，余热烘干胶塞备用（也可经101.3kPa高压灭菌）。（4）金属器械的清洗新购金属器械：汽油纱布擦去油脂，清水冲洗®酒精棉擦拭，晾干；用过的金属器械：清水煮沸消毒®擦拭干净®包装

4、好高压灭菌消毒。3、器械包装瓶类——硫酸纸+牛皮纸+绳子扎紧小器皿、胶塞、刀剪等——饭盒吸管、滴管接口部用脱脂棉塞上，装入消毒筒内无菌衣、帽、口罩均以牛皮纸或包布包好，绳子扎好4、消毒灭菌（1）干烤——玻璃器皿160～170℃90～120min，或180℃45～60min，金属器械、橡胶制品、塑料制品不能用干烤（2）高压蒸汽灭菌——培养用液、橡胶制品、塑料器皿——67.55kPa（115℃）×10min；玻璃器皿、金属器械等可用101.33kPa（121.3℃）×15～20min（3）滤过除菌——不耐热培养液和试剂（4）紫外线——消毒物品表面结

5、果分析和讨论：思考题：1、细胞培养室和超净工作台的消毒要求有哪些？；2、分别叙述玻璃培养瓶、培养液、PBS的消毒灭菌方法。;实验二细胞计数及密度换算一、目的要求：通过L929或HGC-27细胞的细胞计数，掌握准确计数细胞，掌握细胞密度的换算方法。掌握细胞计数板的使用和计数方法；掌握细胞密度换算方法二、实验材料：L929或HGC-27细胞，血球计数板，倒置显微镜，计数器等。三、操作步骤：1、样品：取单细胞悬液，稀释到一定比例；2、检查记数板：在正式计数前，先用显微镜检查记数板的计数室，看其是否沾有杂质或干枯的菌体。若有污物，则需作以下几步清洗：（

6、1）擦洗。用药棉蘸取95%酒精，轻轻擦洗计数板的计数室。（2）冲洗。用蒸馏水冲洗计数板，并用毛边纸吸干其上的水分（注意：勿用火焰来烤干）最后用擦镜纸揩干净。（3）镜检。镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时，才可用于细胞的计数。加样：先将盖波片安方在计数室上面，然后摇匀样品取悬液，使它沿着盖玻片和计数板间的缝隙渗入计数室，连续2~3次，直至充满计数室平台为止。3、计数：将加好样品的记数板置于显微镜载物台的中央，然后按下列步骤操作：（1）找计数室。先在低倍显微镜下寻找计数板上的大方格位置。寻找时显微镜的光圈要适当缩小，使视野偏暗。然后顺着大方格线

7、，移动计数板，使计数室位于视野中间。（2）转高倍镜。转至高倍镜后，适当调节光度，使细胞和计数室线条均清晰为止。然后将计数室一角的中格移至视野中。（3）计数：计数时应巡一定的路径，对横跨刻度上的细胞，依照“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数。计数细胞时，数四个大方格的细胞总数。（4）计算：细胞密度：细胞数/原液体积（ml）＝（四个大方格内细胞数之和/4）×104若原液稀释一定倍数后，再进行细胞计数，则原液中细胞密度：细胞数/体积（ml）＝（四个大方格内细胞数之和/4）×104×稀释倍数四、思考题：1、在细胞计数操作过程中，哪些因素可影响细胞密

8、度？2、计算：将原液作，10倍稀释后，通过细胞计数，已知四个大方格的细胞数之和为48个，试计算原液中的细胞密度；欲配制每毫升含10个细胞的细胞悬液共2