奶牛乳房炎酵母样真菌的分离鉴定与荧光定量PCR检测方法的建立.pdf

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1、巧去单化论义奶牛乳房炎酵母样真菌的分离鉴定与焚光定量ＰＣＲ检测方法的建立张利平■Ｉ．．．＇．■．？．．－．．：一？－爲席乂榮二０—六年五月‘‘．／．；＇－－－■■，分类号Ｓ％８．２３密级么开ＵＤＣ硕±学位论文奶牛乳房炎酵母样真菌的分离鉴定与焚光定量ＰＣＲ检测方法的建立张利平学科专业临床兽医学指导教师何宝禅（教授）论文答辩日期２０１６．５．２３学位授予日期２

2、０１６．６．３０答辩委员会主席郑喜邦（教授）论文评阅人本论文由南宁市西乡塘区科学研巧与技术开发项目资助合同编号；２０１４３０８ＴｈｉｓａｅｒｗａｓｆｕｎｄｅｄｂｒａｎｔｆｒｏｍｔｈｅＮａｎｎｉｎＸｉｘｉａｎｔａｎｓｃｉｅｎｃｅｐｐｙｇｇｇｇｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｌｉｅｃｈｎｏｌｏｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｒｏｅｃｔｓｇｙｐｐｊＮｏ．２０１４３０８广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究

3、所取得的研究成果。除己特别加标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研巧；成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料一。与我同工作的同事对本论文的研巧王作所做的贡献均己在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归目属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，Ｐ：学校有权保存并向国家有关部口或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可Ｗ将学位论文的全部或部

4、分内容编入有关数据库进行检索和传播，可Ｗ采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于；□保密，在年解密后适用授权。＾不保密。＂＂请在Ｗ上相应方框内打Ｖ（）０论文作者签名／．豕：雖刪孚日期：艺＜５么０指导教师签名：日期，／谷奶牛乳房炎醇母样真菌的分离鉴定与巧光定量ＰＣＲ检测方法的建立摘要奶牛真茵性乳房炎常因误诊耽误正确的治疗而变成顽固性乳房炎。为调查南宁市某牛场奶牛乳房炎酵母样真菌的感染情况Ｗ及主要病原真菌种类，本试验采集该

5、牛场乳样１９８份，经体细胞计数检测，结合奶牛产奶量，临床表现，乳样外观等，检测到临床型乳房炎孰样９２份（４６．４６％），隐性乳房炎乳样１７份（８．５８％），对这些乳样进行酵母样真菌的分离鉴定，其中有５１份乳样中分离到酵母样真菌。经假菌丝及酵母样真菌生化管鉴定，查－Ｃ酵母样真茜生化鉴定编码册看ＴＨ１５，鉴定结果如下；３７份乳样中分离到白色念珠菌（７２．５４％），６份乳样中分离到巧码念珠菌（１１．７６％），６份乳样中分离到奥么毕赤酵母菌（１１．７６％），２份郭样中分离到胶粘红酵

6、母菌（３．９４％）。随机选取２１株临床分离酵母样真茜菌株，用４种抗真菌药敏纸片和４种抗生素药敏纸片对其进行药敏试验，结果它们均对制霉菌素有较高的敏感性，大部分菌株对两性霉素Ｂ、丽康嗤中度敏感，几乎全部菌株对氣康嗤Ｗ及下胺卡那、头抱曲松、庆大霉素、链霉素耐药。本试验结果为南宁市该牛场乳房炎酵母样真菌感染的治疗提供了用药参考，且为此类乳房炎的综合防治提供了理论基础。奶牛真菌性乳房炎会给奶牛乳房组织造成不同程度的、不可逆转的病理性损伤。其中白色念珠菌是引起奶牛真菌性，

7、甚至导致奶牛被淘汰或死亡Ｉ一乳房炎的最主要致病菌之。临床上仍然使用传统培养法检测白色念珠菌，一该方法耗时较长，可能会延误治疗而导致动物病情加重。故有必要建立种可ｙＡ快速准确诊断奶牛乳房炎白色念珠菌的方法。本研究依据白色念珠一菌的ＩＴＳ２序列设计了对引物，建立了可ｙｊ／陕速诊断白色念珠菌的ＳＹＢ民－Ｃ民方法ＧｒｅｅｎＩ巧光定量Ｐ。本试验所得白色念珠菌巧光定量ＰＣ民反应的＝２－＝标准曲线方程为；ｙ３．４４８ｘ＋３９．７２，其线性系数民１．００，其扩增效率为９５％，１可检测

8、白色念珠菌质粒的最低浓度为１．０３ｘ１０拷贝／ｕＬ。通过融解曲线分析－°Ｔｍ值为８７－确定该反应白色念珠菌的．２５Ｃ８８．２５Ｃ。使用本试验建立的ＳＹＢ民Ｇｒｅｅｎ－Ｃ民Ｉ巧光定量Ｐ反应分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，无乳链球菌等多种乳房炎致病菌进行扩增，均无融解曲线产生，证明该反应的特异性良好。重复性试验结果，五个浓度标准品的批内变异系数分别为〇〇〇〇〇〇ｉ０．〇．／〇，批间变．〇．．９０％，０．３９／，０３４／，０．１３％，０１２异系数分另ｊ为