专题1基因工程 1.2基因工程的基本操作程序.ppt

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1、专题1　基因工程1.2　基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序获取目的基因构建表达载体导入受体细胞目的基因检测与鉴定第一步第二步第三步第四步基因工程的基本操作流程图一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取目的基因1.基因组文库将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。2.部分基因文库受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。3.基因文库的构建（1）基因组文库的构建提取某生

2、物全部DNA用适当限制酶切割许多DNA片段与载体连接导入受体菌群该生物基因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文库的构建——mRNA反转录形成mRNA逆转录酶杂交双链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链DNA与载体连接导入受体菌群该生物cDNA文库非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子终止子基因的结构启动子原核真核结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA（二）利用PCR技术扩增目的基因1.原理PCR是聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）,它是利用DNA双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断的加

3、以复制，使其数量呈指数方式增加。因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。2.过程高温变性（90~95℃）低温退火（55~60℃）中温延伸（70~75℃）双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的，因此整个过程不需要解旋酶。多次重复3.特点：指数形式扩增（三）通过DNA合成仪直接合成目的基因DNA合成仪蛋白质的氨基酸顺序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推测推测合成当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。二、基因表达载体的构建用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏

4、性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子，即基因表达载体。质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA（一）构建目的使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。（二）构建零件及其作用1.目的基因2.启动子RNA聚合酶识别和结合的一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶与之结合才能驱动基因转录出mRNA，进而获得需要的蛋白质。3.终止子一段特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。4.标记基因鉴别受体细胞中

5、是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。三、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。导入受体细胞的方法主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径，且因受体细胞的不同而不同。1.农杆菌转化法（一）导入植物细胞2.其他方法（见教材P12“生物技术资料卡”）（1）基因枪法（2）花粉管通道法（二）导入动物细胞显微注射技术含目的基因的表达载体动物的受精卵含目的基因的受精卵早期胚胎雌性动物输卵管或子宫转基因动物显微注射分裂分化移植发育问题为什么将

6、目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵？（三）导入微生物细胞2.优点繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、操作简单、价格低廉。3.常用受体细胞大肠杆菌（E.coli）1.过程（1）制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2）处理细菌，使细菌易于接受外源DNA分子。（2）重组DNA分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。Ca2+处理法四、目的基因的检测与鉴定目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行。（一）分子水平1.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了

7、目的基因提取受体生物全部DNA适当限制酶切割DNA片段用同位素标记的目的基因片段杂交显出杂交带（表明目的基因已插入）分子杂交技术2.检测目的基因是否转录出了mRNA提取受体生物的mRNA用同位素标记的目的基因片段杂交显出杂交带（表明目的基因已转录出了mRNA）检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA利用的是DNA与mRNA杂交。3.检测目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交技术提取受体生物的蛋白质与相应抗体杂交显出杂交带（表明目的基因已形成蛋白质产品）（二）个体水平例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达

8、。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。