1.2 基因工程的基本操作程序.ppt

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1、专题1基因工程1.2基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取目的基因：主要是编码蛋白质的结构基因常用方法有：从基因文库中获取利用PCR技术扩增人工合成如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。（一）从基因文库中获取目的基因基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）1.基因文库将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。2.基因文库的构建方法

2、供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶载入受体细胞每个受体菌含有一段不同DNA导入（一）从基因文库中获取目的基因目的基因的mRNA杂交双链(单链RNA/单链DNA)单链DNA反转录酶核酸酶HDNA聚合酶双链DNA(cDNA)3.基因组文库和cDNA文库的区别（一）从基因文库中获取目的基因文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）无有基因中内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段）无有基因多少某种生物部分基因某种生物全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以(二)利用PCR（聚合酶链式反应）技术扩增目的基因2.原理：利用DNA双

3、链复制原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。1.发明：这项技术是由穆里斯等人于1988年发明的，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物打开DNA双链模板合成子链原料催化子链合成使DNA聚合酶能从引物3’端开始连接脱氧核苷酸参与的组分在DNA复制中的作用PCR技术变性（80-100℃）DNA母链4种dNTPTaq聚合酶20—30个核苷酸构成DNA或RNA(二)利用PCR（聚合酶链式反应）技术扩增目的基因2.原理：(二)利用PCR技术扩增目的基因PCR扩增仪变性复性延伸每个循环包括：(三)直接人工合成基因

4、比较小，核苷酸序列又已知。DNA合成仪根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNA核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。二、基因表达载体的构建——核心质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种（一）构建过程二、基因表达载体的构建（二）表达载体组成1、目的基因：2、启动子：3、终止子：4、标记基因：外源DNA分子的有效片段。一段有特殊结构的DNA片段，位于基因首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，是负责驱动基因转录出mRNA的。位于基因尾端，起终止转录的作用。鉴别受体

5、细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。三、将目的基因导入受体细胞（一）转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞吸收三、将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法：农杆菌可以感染双子叶植物和裸子植物。当植物受伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体的DNA上。三、将目的基

6、因导入受体细胞显微注射法：首先将含有目的基因的表达载体提纯，并使DNA浓度保持在1～3μg/ml；然后，从雌性动物体内取出卵，采用显微注射仪进行显微注射；再将注射了目的基因的受精卵，移植到雌性动物输卵管或子宫内，使其发育成为具有新性状的动物。大肠杆菌细胞最常用的转化方法首先用Ca2+处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞。第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。三、将目的基因导入受体细胞感受态细胞吸收DNA分子：四、目的基因的

7、检测与鉴定——检查是否成功检测—鉴定——①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交抗原抗体杂交GAMEOVER人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是A、提高受体细胞在自然环境中的耐药性B、有利于对目的基因是否导入进行检测C、增加质粒分子的分子量D、便于与外源基因连接现有一长度为1000碱基对(by）的DNA分子，用限制性核