1.2_基因工程的基本操作程序1

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1、1.2基因工程的基本操作程序四个基本步骤：步骤一：目的基因的获取目的基因是人们所需要转移或改造的基因,获取目的基因是实施基因工程的第一步。目的基因的提取方法直接分离基因人工合成基因反转录法根据已知的氨基酸序列合成DNARNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。②转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。③转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。与RNA聚合酶结合位点原核细胞的基因结构编码区非编码区（补充知识）基因的结构1、原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游启动子终止子能转

2、录相应的信使RNA，能编码蛋白质①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。启动子2、真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游能够编码蛋白质的序列不能够编码蛋白质的序列内含子：外显子：某生物体内全部DNA许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库直接分离基因基因文库:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因基因文库基因组文库部分基因文库如：cDNA文库某种生

3、物某个时期的mRNAcDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入cDNA文库根据已知的氨基酸序列合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？1）DNA序列自动测序仪：2）PCR技术：对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。利用PCR技术扩增目的基因又称聚合酶链式反应(polymerasechainrea

4、ction)通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。引物5’5’3’3’Mullis的构思特定DNA片段5’5’5’5’3’3’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’利用PCR技术扩增目的基因TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020DNA聚合酶？耐热①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、_______________、_____

5、______、___________.②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）聚合酶链式反应体外特定DNA片段已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸引物DNA聚合酶指数2nDNA复制在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链⑤反应过程：a.变性(90～95℃):b.退火(55～60℃):c.延伸(70～75℃):DNA模板解链引物与模板结合，形成局部双链PCR技术与体内DNA复制的区别：1.PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；2.PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚

6、合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；3.PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制受生物体遗传物质的控制。多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是（）A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D．PCR与细胞内DNA复制相

7、比所需要酶的最适温度较高C为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知