DB33T 2247-2020 鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法.pdf

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1、ICS65.020.30B43DB33浙江省地方标准DB33/T2247—2020鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法MethodofRT-PCRandthereal-timeRT-PCRforthedetectionofducktembusuvirusdisease2020-03-03发布2020-04-03实施浙江省市场监督管理局发布DB33/T2247—2020前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则编写。本标准由浙江省农业农村厅提出。本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。本标准起草单位

2、：浙江省动物疫病预防控制中心、浙江省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：云涛、徐辉、周彩琴、张存、赵灵燕、余斌、吴赟竑、张传亮、吴雪军、黄晓兵、冯肖肖、华炯钢、吕见涛、张娟敏、鲍伟华。IDB33/T2247—2020鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法1范围本标准规定了鸭坦布苏病毒的反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和实时荧光定量RT-PCR的实验条件、操作步骤和结果判定等要求。本标准适用于鸭坦布苏病毒核酸的检测。2术语和定义2.1鸭坦布苏病毒（DuckTembusuVirus，DTMUV）属于黄病毒

3、科、黄病毒属、蚊媒病毒类、Ntaya病毒群，可引起鸭、鹅产蛋下降，雏鸭、雏鹅发病死亡。3实验条件3.1主要仪器设备3.1.1PCR仪。3.1.2荧光定量PCR仪。3.1.3微量移液器。3.1.4组织匀浆器。3.1.5电泳仪。3.1.6电泳槽。3.1.7水浴锅。3.1.8紫外凝胶成像系统。3.1.9高速台式低温离心机。3.1.10生物安全柜。3.2试剂3.2.10.01M磷酸盐缓冲液（0.01mol/L，pH7.4PBS）：称取8.0gNaCl、0.2gKCl、2.9gNa2HPO4•12H2O、0.2gKH2PO4，将上述试剂溶于80

4、0mL去离子水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将pH调节至7.4，然后加去离子水定容至1L，高温灭菌30min，室温保存。3.2.2氯仿。3.2.3异丙醇。3.2.4焦炭酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌去离子水：用DEPC50μL，加超纯水至100mL，室温过夜，121℃高压灭菌15min，分装到1.5mLDEPC处理过的离心管，冻存备用。3.2.575%乙醇：取新开启的无水乙醇75mL，加DEPC水至100mL，混匀，-20℃预冷。1DB33/T2247—20203.2.6溴化乙锭（EB）：取1.0g溴化乙锭，加去离子水，定容至100mL

5、。充分溶解后的溴乙锭溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存，其工作浓度为0.5μg/mL。3.2.71×TAE缓冲液：取242g羟基甲基氨基甲烷（Tris）、37.2g二水乙二铵四乙酸二钠、57.1mL冰乙酸，加去离子水定容至1L，配置成50×TAE电泳缓冲液；量取20mL的50×TAE电泳缓冲液，加入去离子水定容至1L，室温保存。3.2.81%琼脂糖凝胶：称取1.0g琼脂糖，加入1×TAE电泳缓冲液100mL，轻轻混匀后加热，使琼脂糖完全熔化。待琼脂糖胶冷至50℃～60℃时，加EB溶液（终浓度0.5μg/mL）或5μL核酸染料，摇匀后倒入

6、制胶板中，厚度为3mm～5mm，室温凝固后取下电泳梳子，备用。3.2.9DNA相对分子质量标准物Marker：DL2000。3.2.1010×加样缓冲液：称取25g聚蔗糖、0.1g溴酚蓝、0.1g二甲苯青，加入灭菌双蒸水定容至100mL。3.2.11商品化的一步法实时荧光RT-PCR反应试剂盒。OneStepPrimeScript™RT-PCRKit（PerfectRealTime，TAKARA)，含有RT-PCR缓冲液，酶混合物，dNTP混合物，无RNA酶的水等。3.2.12M-MLV反转录酶。3.2.13RNA酶抑制剂。3.2.1

7、4TaqDNA聚合酶。3.2.15dNTPs。3.2.16引物：RT-PCR扩增引物,见表1；实时荧光定量RT-PCR引物和探针，见表2。表1RT-PCR扩增引物引物名称引物序列DTMUV引物P15'-GCAACCAGGCAAAGAGGTCATA-3'DTMUV引物P25'-AAGTGAGCCTCATCCATAATGAACA-3'表2实时荧光定量RT-PCR引物和探针引物名称引物序列(5'-3')DTMUV引物P3AAGTCAGGCCAGGGAATCCDTMUV引物P4CATGCACCCAGATTTGTTAACCDTMUV探针FAM-

8、CCGTCATCCAACATC-MGB4操作步骤与结果判定4.1样品采集与处理4.1.1组织器官5.1.1.1用无菌镊子和剪刀采集患病或病死禽类各种组织与器官（肝脏、卵巢、脑、脾脏、胸腺等），装入一次性塑料袋或其它灭菌容