DNA的酶解.ppt

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1、实验二DNA的酶解一、原理所谓DNA酶解就是DNA被限制性内切酶切成大小不等的片段。可用于Southern分析或DNA体外重组等实验限制性内切酶：共有三类，但只有第Ⅱ类识别位点和切点在相同部位，因而是实用的，这类内切酶通常识别DNA中4～6个核苷酸的顺序，识别的顺序为二重对称。酶解产生的DNA片段末尾可以是平齐末端(如HaeⅢ)或粘性末端（如EcoRI）。限制性内切酶（restrictionendonuclease)是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶识别的DNA序列多为4-6个碱基识别的序列都具有回文结构切割后产生平齐末端

2、和粘性末端HpaI5’GTTAAC3’3’CAATTG5’5’GTTAAC3’3’CAATTG5’e.g.HindIHindIIHindIII(流感嗜血杆菌中三个酶Haemophilusinfluenzaed)※第一个字母（大写、斜体）该酶的微生物属名※第二、三个字母（小写、斜体）代表微生物种名※第四个字母（斜体）代表寄主菌的株或型※用罗马数码I、II、III等区分同一株具有不同特异性的酶命名:应用:外源基因与载体的连接（DNA连接酶）粘性末端连接同一限制性内切酶位点连接不同限制性内切酶位点连接平端连接同聚物加尾连接人工接头连接（1）互补粘

3、端DNA或切口间的连接5’ACGOHpAATTCGT3’3’TGCTTAApHOGCA5’ATP、Mg2+T4连接酶5’ACGAATTCGT3’3’TGCTTAAGCA5’反应例解：（2）平端连接5’CGAOHpCGTA3’3’GCTpOHGCAT5’ATP、Mg2+T4连接酶5’CGACGTA3’3’GCTGCAT5’酶单位定义：在最适温度，最适pH条件下，一小时完全水解1µgλ噬菌体DNA所需的酶量定为1个单位(u)。二、方法1．取0.1µg／µlλDNA溶液10µl于一干净的0.5mlEppendorf管中。2．加10×HindⅢ酶解缓冲液

4、2µl，0.4u/µlHindⅢ5µl，双蒸水3µl，使反应总体积20µl,充分混匀。3．在37℃水浴中保温2hr，保温结束后加2µl终止液，混匀。4．电泳观察酶解结果。酶解体系加入物质体积作用0.1µg／µlλDNA10µlλ噬菌体DNA10×HindⅢ酶解缓冲液2µl维持pH值，离子强度0.4u/µlHindⅢ5µl限制性内切酶双蒸水3µl补足体积，达到一定浓度充分混匀，37℃水浴中保温1hr终止液(EDTA/甘油/溴酚兰)2µl三、注意事项1．限制性内切酶较昂贵，且极易失活，要特别注意酶活力的保存，酶保存缓冲液一般有10mmol/LTris

5、-HCl(pH7.4)，50～100mmol/LNaCl或KCl，lmmol/LDTT，100～200µg／mlBSA(保持蛋白浓度，使酶稳定)，50％甘油(存于-20℃不结冰，结冰反复解冻使酶失活)2．限制性内切酶用量极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中3．注意酶切时加样次序：水、缓冲液、DNA、最后才加酶取液时，Tip要从溶液表面吸，以防Tip沾去过多酶，待用的内切酶要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回—20℃冰箱，防止限制性内切酶的失活4．凡用在酶切反应中的一切塑料器皿，都要净水清洗，湿热灭菌，镊子夹取，不直接用手去拿，以防

6、手上杂酶污染