《DNA复制的酶学》PPT课件

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1、第二节DNA复制的酶学DNA复制的体系底物:dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP);聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶,简写为DNA-pol或DDDP;模板(template):解开成单链的DNA母链;引物(primer):提供3´-OH末端的寡核苷酸;其他的酶和蛋白质因子一、DNA聚合酶催化dNTP聚合到核酸链上的酶。是DNA复制的主要酶。全称叫依赖DNA的DNA聚合酶(DNAdependentDNApolymerase)或DNA指导的DNA聚合酶(DNA-directedDNApolymerase

2、),均缩写为DDDP。(一)DNA聚合酶催化的反应1.5´至3´的聚合活性催化四种dNTP一个一个地接到DNA链上去。(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi聚合反应机理:聚合反应的特点:(1)以单链DNA为模板(2)以dNTP为原料(3)引物提供3´-OH(4)聚合方向为5´→3´2.核酸外切酶活性3´→5´外切酶活性:切除错配的核苷酸5´→3´外切酶活性:切除引物切除突变的片段(二)DNA聚合酶的种类1.原核生物的DNA聚合酶pol-Ipol-IIpol-III5´→3´聚合酶活性+++3´→5´外切酶活性+++5´→

3、3´外切酶活性+–+功能切除引物填补空隙修复合成不清复制的主要酶DNA-polI:单一肽链的大分子曾被称为复制酶(replicase)含量最多可被水解成两个片段小片段(N端):具有5´→3´外切酶活性;大片段(C端):具有聚合活性和3´→5´外切酶活性,也称为Klenow片段,是常用的工具酶。DNA-polIII:由10种亚基组成的不对称聚合体催化效率最高2.真核生物的DNA聚合酶DNA-pol复制中延长随从链DNA-pol没有其他pol时才起作用DNA-pol催化线粒体DNA的复制DNA-pol复制中延长领头链DNA-pol

4、校读、修复和填补缺口(三)复制的保真性(fidelity)至少依赖三种机制:1.遵守严格的碱基配对规律;2.聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能;3.复制中的即时校读功能。二、解旋解链酶类解开并理顺DNA双链,维持DNA处于单链状态。主要有解螺旋酶、DNA拓扑异构酶和单链DNA结合蛋白。(一)解螺旋酶(helicase):模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对,而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把DNA解开成单链,它才能起模板作用。解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋白质,当时称为rep蛋白。作用是利用ATP供能,解开DNA双链。复制相关蛋

5、白的基因:dnaA、dnaB、dnaC……dnaX相应的表达产物蛋白质:DnaA、DnaB、DnaC……DnaXDnaA:辨认复制起始位点DnaB:解螺旋酶DnaC:辅助解螺旋酶使其在起始点上结合并打开双链。(二)单链DNA结合蛋白(SSB):SSB曾被称为螺旋反稳定蛋白(HDP)。在大肠杆菌,它是由177个氨基酸残基组成的同四聚体,结合单链DNA的跨度约32个核苷酸单位。SSB与解开的DNA单链紧密结合,防止重新形成双链,并免受核酸酶降解。在复制中维持模板处于单链状态。(三)DNA拓扑异构酶(topoisomerase):拓扑:是指

6、物体或图像作弹性移位而又保持物体不变的性质。拓扑异构酶:是一类可改变DNA拓扑性质的酶。对DNA分子的作用是既能水解、又能连接磷酸二酯键。可松弛DNA超螺旋,有利于DNA解链。拓扑异构酶I(topoI):在原核生物曾被称为-蛋白。主要作用是切开DNA双链中的一股,使DNA解链旋转中不打结,DNA变为松弛状态再封闭切口。拓扑异构酶II(topoII):在原核生物又叫旋转酶(gyrase)。能切断DNA双链,使螺旋松弛。在ATP参与下,松弛的DNA进入负超螺旋,再连接断端。三、引物酶和引发体引物酶(primase):依赖DNA的RNA聚

7、合酶。催化RNA引物的合成。在大肠杆菌,引物酶是dnaG基因的产物。RNA引物:在DNA模板的复制起始部位由引物酶催化NTP的聚合,形成短片段的RNA,为DNA聚合提供3´-OH末端。引发体(primosome):是由DnaB、DnaA、DnaC以及其他复制因子一起形成复合体,再结合引物酶形成较大的聚合体,结合到模板DNA上。复制开始时,在引发体的下游解开双链,再由引物酶催化引物的合成。四、DNA连接酶(DNAligase)连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端,形成磷酸二酯键,从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链。反

8、应需要ATP。ATPDNA连接酶在复制、DNA修复、重组、剪接中均起缝合缺口作用。是重要的工具酶之一。

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