DNA复制的酶学.ppt

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1、第二节DNA复制的酶学DNA复制的体系底物：dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)；聚合酶(polymerase)：依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol或DDDP；模板(template)：解开成单链的DNA母链；引物(primer)：提供3´-OH末端的寡核苷酸；其他的酶和蛋白质因子一、DNA聚合酶催化dNTP聚合到核酸链上的酶。是DNA复制的主要酶。全称叫依赖DNA的DNA聚合酶（DNAdependentDNApolymerase）或DNA指导的DNA聚合酶（DNA-directedDNApolymerase），均缩写为DDDP。(一)DNA聚合酶催化的反应1

2、.5´至3´的聚合活性催化四种dNTP一个一个地接到DNA链上去。(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi聚合反应机理：聚合反应的特点：(1)以单链DNA为模板(2)以dNTP为原料(3)引物提供3´-OH(4)聚合方向为5´→3´2.核酸外切酶活性3´→5´外切酶活性：切除错配的核苷酸5´→3´外切酶活性：切除引物切除突变的片段(二)DNA聚合酶的种类1.原核生物的DNA聚合酶pol-Ipol-IIpol-III5´→3´聚合酶活性+++3´→5´外切酶活性+++5´→3´外切酶活性+–+功能切除引物填补空隙修复合成不清复制的主要酶DNA-polI:单一肽链的大分子曾被称

3、为复制酶(replicase)含量最多可被水解成两个片段小片段(N端)：具有5´→3´外切酶活性；大片段(C端)：具有聚合活性和3´→5´外切酶活性，也称为Klenow片段，是常用的工具酶。DNA-polIII:由10种亚基组成的不对称聚合体催化效率最高2.真核生物的DNA聚合酶DNA-pol复制中延长随从链DNA-pol没有其他pol时才起作用DNA-pol催化线粒体DNA的复制DNA-pol复制中延长领头链DNA-pol校读、修复和填补缺口(三)复制的保真性(fidelity)至少依赖三种机制：1.遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；3.复制中

4、的即时校读功能。二、解旋解链酶类解开并理顺DNA双链，维持DNA处于单链状态。主要有解螺旋酶、DNA拓扑异构酶和单链DNA结合蛋白。(一)解螺旋酶(helicase):模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对，而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把DNA解开成单链，它才能起模板作用。解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋白质，当时称为rep蛋白。作用是利用ATP供能，解开DNA双链。复制相关蛋白的基因：dnaA、dnaB、dnaC……dnaX相应的表达产物蛋白质：DnaA、DnaB、DnaC……DnaXDnaA：辨认复制起始位点DnaB：解螺旋酶DnaC：辅助解螺旋酶使其在起始点上结合并打开双链。

5、(二)单链DNA结合蛋白(SSB):SSB曾被称为螺旋反稳定蛋白（HDP）。在大肠杆菌，它是由177个氨基酸残基组成的同四聚体，结合单链DNA的跨度约32个核苷酸单位。SSB与解开的DNA单链紧密结合，防止重新形成双链，并免受核酸酶降解。在复制中维持模板处于单链状态。(三)DNA拓扑异构酶(topoisomerase):拓扑：是指物体或图像作弹性移位而又保持物体不变的性质。拓扑异构酶：是一类可改变DNA拓扑性质的酶。对DNA分子的作用是既能水解、又能连接磷酸二酯键。可松弛DNA超螺旋，有利于DNA解链。拓扑异构酶I（topoI）:在原核生物曾被称为－蛋白。主要作用是切开DNA双链中的

6、一股，使DNA解链旋转中不打结，DNA变为松弛状态再封闭切口。拓扑异构酶II（topoII）:在原核生物又叫旋转酶(gyrase)。能切断DNA双链，使螺旋松弛。在ATP参与下，松弛的DNA进入负超螺旋，再连接断端。三、引物酶和引发体引物酶(primase):依赖DNA的RNA聚合酶。催化RNA引物的合成。在大肠杆菌，引物酶是dnaG基因的产物。RNA引物：在DNA模板的复制起始部位由引物酶催化NTP的聚合，形成短片段的RNA，为DNA聚合提供3´-OH末端。引发体(primosome):是由DnaB、DnaA、DnaC以及其他复制因子一起形成复合体，再结合引物酶形成较大的聚合体，结合

7、到模板DNA上。复制开始时，在引发体的下游解开双链，再由引物酶催化引物的合成。四、DNA连接酶（DNAligase）连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链。反应需要ATP。ATPDNA连接酶在复制、DNA修复、重组、剪接中均起缝合缺口作用。是重要的工具酶之一。