Northern Blot实验方法.doc

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1、NorthernBlot实验方法一、胶的配制(试剂盒中已有)二、样品配制试剂加样量RNAloadingbuffer3μLmiRNA7μL将微量离心管盖严，将RNA溶液置于70℃温育5分钟后，用冰水浴冷却样品，离心5秒钟，使管内所有液体沉降至管底。三、凝胶电泳用0.5XTBE作为电泳缓冲液，预跑空胶（撕下空胶板底部封住的胶布，为了使其通电），60V（恒压）,30min。加10μLRNA样品到一个15%尿素聚丙烯酰胺凝胶，留出两边最外侧的加样孔加入5μRNA分子标准样品作为Marker。注：不同的RNA

2、样品可以被加载到凝胶与一个单一的miRNA探针或相同的检测60V（恒压）运行，直到溴酚蓝达大约距离凝胶底部3厘米的处停止，大约两小时左右。四、转膜1、转移凝胶至充满0.5XTBE缓冲液的玻璃盘中。2、提前将膜与滤纸浸泡在0.5XTBE中半小时。3、组装转膜装置：一个纤维垫，一个滤纸，凝胶，膜和一张滤纸，一纤维垫4、确保凝胶在负极侧，膜在正极侧的一面，转移盒里倒满预冷的0.5xTBE。6、60V，在寒冷的房间或冰箱里转移1小时7、转移后，RNA用紫外交联仪固定8、在42℃干燥15分钟。(若无条件，7、

3、8两步可以省去。)一、杂交1）膜放入杂交管（科宁50毫升的一次性管）。（2）利用dH2O泡膜，然后倒去dH2O（3）放入预热的NBhybridizationbuffer4毫升（预热到42℃）。（4）转动杂交管42℃，30分钟（5）倒掉缓冲液，加入新鲜的预热的NBhybridizationsolution4毫升（预热到42℃）（6）加10μLRNA探针，42℃杂交过夜。（7）用20ml1xNBhybridizationwashbuffer.在瓶中冲洗膜。（8）添加NBhybridizationwash

4、buffer20毫升，42℃旋转30分钟。二、检测（1）用镊子将膜转移到杂交管容器（200mL杂交管）。每个管里可以有一个完整的膜或者两个一半大小的膜（在后面所有的孵育步骤中不能使膜重叠。（2）用10ml1XDetectionwashbuffer洗膜。（3）用15mlBlockingbuffer封闭膜，室温，30分钟适度摇晃。（4）用1ml1XBlockingbuffer稀释15µL辣根过氧化物酶标记的亲和物，转移到容器。不要把酶稀释液直接加到膜上。（5）室温下持续振动膜45分钟。（6）倒出封闭缓冲

5、液，用1xDetectionwashingbuffer15ml洗三次（室温），每次洗涤10分钟（7）等量混合底物A和B，将膜放在检测板上，用1.8ml底物溶液覆盖膜，盖上压片膜，确保底物均匀分布在膜上，去除膜上的气泡。在室温下孵化5分钟。（8）去除多余的底物，使用化学发光成像系统曝光膜。八、结果（如下图）