northern blot的实验流程

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1、按大小分离RNA:在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行的RNA电泳1.试剂及其配制1)甲醛（37%-40%溶液，12.3mol/L）：配制100ml,37-40ml的甲醛溶液，加入DEPC处理的水定容到100ml。2)甲酰胺（去离子）3)10×MOPS电泳缓冲液（1L）a)将41.8g的MOPS溶解于700ml灭菌的DEPC处理的水中，用2N的NaOH调整到pH值为7.0。b)加20mlDEPC处理的1mol/L的乙酸钠和20mlDEPC处理的0.5mol/LEDTA（pH=8.0），用DEPC处理的水将溶液的体积调整到1L。c)通过一个0.45um的微孔滤膜过滤灭菌溶液

2、，同时，将其在室温下避光贮存。4）RNALoadingBuffer(+EB)：TaKaRa2．配制含有2.2mol/L甲醛的琼脂糖凝胶（100ml1.5%)1)称量0.375g琼脂糖到18ml灭菌水中,用微波炉法溶解琼脂糖，将溶液冷却至55℃。2)加入2.5ml10×MOPS电泳缓冲液，4.5ml去离子甲醛，在化学通风橱中灌制凝胶。3.处理样品以及RNAmarker向4μl的RNA样品（RNAmaker同理）中加入4μlRNAloadingbuffer，震荡混匀厚稍离心，然后65℃水浴10min，速冷后即可使用。4.电泳电泳槽中加入1×MOPS缓冲液，于4~5V/

3、cm电压下电泳，大约1h左右。变性RNA在膜上的转移和固定1转移胶的制备：1)用DEPC处理的水淋洗胶。2)将胶浸入5倍体积的0.01mol/LNaOH-3mol/LNaCl中20min。3)将凝胶转移至一个玻璃干烤皿内，用锋利的刀片修去凝胶的无用部分以保证胶与膜对齐。4)用长和宽均大于凝胶的玻璃板作为平台，将其放在大干烤皿内，上面放一张滤纸。5)于干烤皿内倒入相应的转移缓冲液（带正电荷的膜用0.01mol/LNaOH-3mol/LNaCl）直至液面略低于平台表面，当平台上方的滤纸完全湿透后，用玻璃棒或移液管赶走所有的气泡。2转移膜的准备：1)裁剪和胶一样大小的尼

4、龙膜。2)将尼龙膜漂浮在去离子水表面直至全部湿透，然后讲膜进入10×SSC中至少5min。3转移系统的安装和RNA的转移：1)将胶倒转后置于平台上的滤纸中央，确保滤纸和胶之间无气泡。2)用保鲜膜围绕凝胶周边，而不是覆盖凝胶。3)在胶的上方覆盖湿润的尼龙膜，并确保胶与膜之间无气泡。4)用相应的转移缓冲液浸湿两张与胶大小一致的滤纸，放于湿润的尼龙膜上，用玻璃棒赶走所有气泡。5)剪一叠5~8cm厚，略小于滤纸的纸巾，放于滤纸之上，在放一块玻璃板，然后压上400g重物。6)转移过夜。7)拆除毛细管转移系统，用铅笔标明膜的正面，将膜转移至50ml6×SSC中，于摇床上室温轻

5、摇5min。8)从6×SSC溶液中取出凝胶，将多余的液体沥干后，将膜的RNA面向上放置于干的滤纸上数分钟。4RNA固定在带正电荷的尼龙膜上：待膜在空气中晾干后，将干燥的膜夹在两张滤纸之间，120℃烤30minDIG-DNA标记以及纯化1.标记探针：1)加入1μg的模板的DNA，然后加入ddH2O到16μl。2)通过煮沸10min使DNA变性然后快速放入冰浴10min（完全变性对于有效标记探针很重要）。3)混合DIG-Highprime并加入4μl到变性的DNA中，混合并简单离心，37℃孵育2hr。4)停止反应：65℃水浴10min。2.探针纯化（MiniColum

6、nDNAfragment）：1)抖动minispin，使其中的凝胶混匀，打开标帽，去掉帽尾。2)将minispin放入一个Eppendorf管中，1000g离心1min。3)取新的Eppendorf管，将minispin放入管中，将标记好的探针点在凝胶中央，1000g离心1min，收集离心后的液体。预杂交及杂交1)预杂交：预杂交液5ml预热到42℃，将膜放入杂交瓶中，温育膜2hr。2)将预热的42摄氏度杂交液5ml放入密闭的塑料袋中，加入探针约250ng（每ml杂交液中50ng探针），混匀。将预杂交后的膜转移到密闭塑料袋中，42℃杂交过夜。洗膜1)杂交后，将膜迅速

7、转移至足够的2×SSC，0.1%SDS中连续震荡两次，每次5min。2)在68℃，用足够的0.5×SSC，0.1%SDS（提前预热到洗涤温度）连续震荡两次，每次15min。免疫检测（地高辛杂交检测试剂盒Ι）1．制备试剂盒工作液溶液组分/制备阻断液用顺丁烯二酸缓冲液1:10稀释10×阻断液，制备成1×工作液抗体溶液每次使用前，需10000rpm离心抗Dig-AP酶结合物5min，从表面小心吸取所需的量。用阻断液按1:5000稀释抗体显色底物液加200μlNBT/BCIP到10ml检测缓冲液中2．步骤1)在杂交和严谨洗涤之后，在洗涤缓冲液中浸润5min。2)在10ml

8、阻断液中孵