rna提取和northern blot

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1、模块二总RNA的提取与Northern杂交一、总RNA的提取1.实验目的核酸是生物遗传的物质基础，决定生物体的遗传、变异、生长和发育。在基因工程中，核酸分子是主要的研究对象，因此核酸的分离、提取是分子生物学研究中很重要的技术。RNA是用来在转录水平上研究基因的表达与调控机制的载体，它是基因操作的重要对象，纯度高、浓度高、完整性好的RNA为基因的下游操作可以提供良好的保证，RNA的提取是基因工程操作中最常用、最基本的实验技术。RNA的提取对分子生物学的研究至关重要。纯度高、完整性好的RNA可以用于Northern杂交、mRNA纯化、cDNA文库的构建和体外

2、翻译、RT-PCR等。RNA主要存在于细胞质中，约占75％，另外10％在胞核中，15％在细胞器中。RNA主要包括3种：rRNA占80％~85％；tRNA占l0％~15％；mRNA占1％~5％。本实验以芜菁直根皮为材料，学习植物基因组织总RNA的快速提取。通过本实验使学生学习掌握甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的方法和技术。2.实验原理RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂硫氰酸胍，可以溶解蛋白质、破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNAase，所以RNA从细胞中

3、释放出来时不会被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过苯酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。硫氰酸胍—酚—氯仿法提出RNA：硫氰酸胍与β-巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；硫氰酸胍使蛋白质变性，从而释放RNA。甲醛与谷氨酸残基的单亚氨基基团形成不稳定的碱基配对，这些配对通过阻止链内碱基配对而是RNA维持在变性状态。由于此种配对不稳定且容易被稀释除去，因此只有当甲醛存在于缓冲液或凝胶中时，RNA才能维持在变性状态。变性消除了二级结构的单链RNA在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率与其大小的对数成正比。有溴化乙锭存在时，电泳后

4、28SrRNA和18SrRNA应当能清楚地在紫外灯下看到，有时能看到一条由tRNA和5SrRNA组成的、较模糊、迁移较快的带。如果RNA没有被降解，28SrRNA的亮度应当是18SrRNA亮度的1.5-2.0倍，且这两条带都没有弥散现象。mRNA是不可见的，除非过量上样。3.实验设备移液器，tip头，tip头盒、台式高速离心机，研钵，1.5ml离心管，三角瓶，磁力搅拌器，试剂瓶，-80℃冰箱，水平凝胶电泳槽，稳压电泳仪，微波炉，50ml三角瓶4.实验试剂RNA提取液：0.8mol/L盐酸胍，0.4mol/L硫氢酸铵，0.1mol/L醋酸钠（pH5.0），

5、5%甘油，38%Tris-饱和酚。810×MOPS缓冲液（吗啉代丙烷磺酸，2-(N-morpholino)propanesulfonicacid）：0.2mol/LMOPS，50mmol/L醋酸钠，10mmol/LEDTA。RNA上样缓冲液：62.5%去离子甲酰胺，16%10×MOPS，22%甲醛。电泳缓冲液：用无菌水稀释10×MOPS，使终浓度为1×MOPS。其他试剂：琼脂糖，1mg/ml溴乙锭，溴酚蓝，甲醛，β-巯基乙醇，氯仿，异戊醇，75%乙醇，1.2MNaCl，异丙醇，灭菌的ddH2O。5.实验步骤（1）于1.5mlEppendorf管中加入1m

6、lRNA抽提液、30µlβ-巯基乙醇。（2）用液氮预冷研钵及三角瓶、钥勺，将直根皮放入预冷研钵后，加入液氮，迅速冷冻后快速研磨至粉末状。（3）迅速用钥勺加粉末于抽提液中，剧烈震荡混匀10分钟。（4）加入350µl氯仿/异戊醇，剧烈震荡混匀5分钟。4℃、12000rpm离心15min。（5）取上清液于一新管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，剧烈震荡混匀10分钟。4℃、12000rpm离心10min。（6）取上清液于一新管中，加入300µl1.2MNaCl、等体积异丙醇，混匀室温放置10min。（7）4℃、12000rpm离心10min，弃上清，75%酒精洗沉淀

7、，4℃、12000rpm离心5min。弃上清，空气干燥10-20min，加20µl无菌水溶解沉淀。（8）用透明胶带将胶板的两端封好。（9）电泳胶的制备试剂用量琼脂糖(0.8%)0.16g10×MOPS4.8ml水15.2ml（10）倒胶：在距底板0.5-1.0mm的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中（注意不要出现气泡），凝胶厚度在3-5mm之间。（11）RNA样品变性：在1.5ml灭菌离心管中加入3.2ml上样缓冲液，1.3mlRNA样品，混合震荡，使之充分混匀，手掌离心机离心10s。65℃金属浴5min，冰上冷却后，手掌离心机离心10s。（1

8、2）在凝胶完全凝固后（室温下30-40min），撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装