northern blot技术

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1、核酸杂交技术(SouthernBlot、NorthernBlot）（一）SouthernBlot原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二…（一）SouthernBlot原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如

2、果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态,如是否有点突变、扩增重排等。（二）NorthernBlot原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同SouthernBlot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。（三）探针标记技术1标记物：放射性和非放射性两种放射性：非放射性：生物素、地高辛素、荧光素2、标记方法（1）切口平移法（2）随机引物法（3

3、）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法northernblot简介　　Northernblot是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northernblot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。Northernblot首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。“Northernblot”这一术语实际指的是RNA分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现在通指整个实验的过程。Northernblot在1977年由斯坦福大学JamesAlw

4、ine，DavidKemp和GeorgeStark发明。Northernblotting实际上依照比它更早发明的一项杂交技术Southernblot（依据生物学家EdwinSouthern名字来命名）来命名，Southernblot主要用来对DNA进行分析。流程首先需要从组织或细胞中提取总RNA,或者再经过寡聚（dT）纯化柱进行分离纯化得到mRNA。然后RNA样本经过电泳依据分子量的大小对被分离，随后凝胶上的RNA分子被转移到膜上。膜一般都带有正电荷，核酸分子由于带负电荷可以与膜很好的结合。转膜的缓冲液含有甲酰胺，它可以降低RNA样本与探针的退火温度，因而可以减少高温环境对RN

5、A降解。RNA分子被转移到膜上后须经过烘烤或者紫外交联的方法加以固定。被标记的探针与RNA探针杂交，经过信号显示后表明需检测的基因的表达。Northernblot实验中阴性对照可以采用已经过RT-PCR或基因芯片检测过的无表达的基因。材料电泳胶　　Northernblot中最为常用的电泳胶是含有甲醛的琼脂糖凝胶，甲醛可以减少RNA的二级结构，电泳完成后的胶可经过EB染色后在紫外下检测RNA的质量。而对小分子的RNA或者microRNA一般采用聚丙烯酰胺变性胶电泳。RNA电泳中可以依据核糖体RNA的大小大致判断条带的大小，28SRNA大小一般为5kp，18SRNA大小一般为2k。

6、28SRNA的亮度一般是18S的两倍。探针　　Northerblot中探针的序列需要和检测目的基因序列互补配对，探针可以是DNA、RNA或者其它的寡聚核苷酸，但最小的长度必须大于25bp，体外合成的RNA探针可以采用更高的退火温度来减少背景中的噪音。探针一般采用P或者地高辛来进行标记。杂交过后，可采用X胶片显色的方法来检测信号。应用　　Northernblot可用来检测不同组织、器官；生物体不同发育阶段以及胁迫环境或病理条件下特定基因的表达样式。如northernblot被大量用于检测癌细胞中原癌基因表达量的升高及抑癌基因表达量的下降，器官移植过程中由于免疫排斥反应造成某些基因

7、表达量的上升，Northernblot还可用来检测目的基因是否具有可变剪切产物或者重复序列。优缺点　　分析基因的表达可以有很多种不同的方法，除northernblot外还有RT-PCR、基因芯片、RNA酶保护实验等。基因芯片常和northernblot一起使用，但通常情况下，northernblot的灵敏度要好于基因芯片实验，而基因芯片优势在于它可在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化。与定量PCR的高灵敏度相比，northernblot显然要逊色不少，但northernblot较高的