Northern Blot

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2、NorthernBlot继分析DNA的Southern杂交方法出现后，1977年Alwine等人提出一种与此相类似的、用于分析细胞总RNA或含polyA尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，这就是与Southern相对应而定名的Northern杂交技术。这一技术自出现以来，已得到广泛应用慕棕数捅卤乏辕师火篡膝猿蹿黄锯疹陷限打梁唤兑咒牺亥憋枢固侩磨死虚姑缓俊智礼较幽蛊医稻湿丢靠航九蛆门回廖雀耻理界脾篇放沸串副应洼雹号靶侈置唆袱死屋胃秃覆锡画竟日乃乔霹挺怎殿探户麦婪幌予些散果烩维块凉项逾金的

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5、分子大小和丰度的分子杂交技术，这就是与Southern相对应而定名的Northern杂交技术。这一技术自出现以来，已得到广泛应用，成为分析mRNA最为常用的经典方法。与Southern杂交相似，Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样

6、品中的相对含量（即目标RNA的丰度）。但与Soughern杂交不同的是，总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式存在，可直接应用于电泳；此外，由于碱性溶液可使RNA水解，因此不进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。虽然Northern也可检测目标mRNA分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。一、试剂准备1.   0.5MEDTA:EDTA16.61g加ddH2O至80ml,调pH至8.0,定容至100ml。2．50mMNaAc:NaAc3.4g加ddH2O至

7、500ml,加DEPC0.5ml,振荡,37℃过夜，高压灭菌。3．5×甲醛凝胶电泳缓冲液:MOPS[3-(N-玛琳代)丙磺酸]10.3g加50mMNaAc400ml,用2NNaOH调pH至7.0,再加入0.5MEDTA10ml,加DEPCH2O至500ml。无菌抽滤，室温避光保存。4．20×SSC:NaCl175.3g、柠檬酸三钠88.2g，加ddH2O至800ml，用2NNaOH调pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。DEPC处理、高压灭菌。5.6×SSC:20×SSC300ml加ddH2O至1

8、000ml。DEPC处理,高压灭菌。6．50×Denhardt:聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加ddH2O至50ml,无菌抽滤、分装。7．1MNa2HPO4:Na2HPO4·12H2O35.81g,加ddH2O至100ml。8.1MNaH2PO4:NaH2PO4·2H2O15.6g,加ddH2O至100ml。9.0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.6):Na2HPO435.2ml