小麦抗寒相关基因克隆及分子标记开发.pdf

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1、IIIIII摘要低温是限制小麦生长、发育以及分布的主要因素之一。寒害的发生经常会导致小麦的严重减产，且一旦发生难于防控，通常只能依靠品种自身的抗性。因此增强小麦的抗寒性已经成为育种工作者的首要目标。植物的抗寒性是一个非常复杂的数量性状，与冬春性相关联又不完全紧密连锁，尽管许多春化基因和抗寒位点被相继报道，但真正能在分子育种生产实践中被利用的却很少。本研究拟克隆春化基因以外的抗寒相关基因，并根据序列间差异开发分子标记，发掘优异等位变异。取得以下主要结论：1、以小麦Wcs19基因的cDNA序列为基础，通过基因步移技术克隆了抗寒小麦品种安农082

2、2中Wcs19基因的5ʹ端上游1310bp序列，利用启动子PLACE和PlantCARE在线分析软件分析发现该基因的5ʹ端上游调控区除了含有典型的具有转录起始功能的TATA-box、CAAT-box外，还含有2个Cor基因保守的CRT/DRE元件。将基因步移获得的Wcs19基因5’上游序列与Wcs19基因编码区进行拼接，共获得一条长为1920bp的序列，并将其定位在小麦的2B染色体上。比较不同抗寒性品种间Wcs19基因的编码区和上游调控区序列，虽然品种之间存在部分SNP，但是这些SNP与25份小麦材料的抗寒性并无相关性。2、以小麦全基因组数

3、据库为基础，分别克隆了Wcor15位于小麦A、B、D基因组上的Wcor15-2A，Wcor15-2B和Wcor15-2D基因。并将其定位在小麦的第2部分同源染色体上。蛋白序列的分析表明，WCOR15-2A、WCOR15-2B和WCOR15-2D都属于能定位到叶绿体的LEA3蛋白家族。比较不同抗寒性品种间Wcor15-2A，Wcor15-2B和Wcor15-2D基因的序列发现：三个基因在不同抗寒性的小麦品种中序列是高度保守的，且保守性Wcor15-2A=Wcor15-2D>Wcor15-2B。结合23个二倍体、10个四倍体和106个来自全国不

4、同麦区的六倍体小麦材料，我们研究了保守基因Wcor15在小麦A、B、D基因组上的进化，结果表明T.urartu可能是四倍体和六倍体小麦Wcor15-2A位点的供体，依次Ae.speltoides可能是四倍体和六倍体小麦Wcor15-2B位点的供体。Ae.tauschii的一个亚种Ae.tauschiissp.strangulata是六倍体小麦Wcor15-2D的供体。通过序列比对，我们也发现在小麦两次异源多倍化的过程中，A和D基因组上的Wcor15基因很稳定没有发生变异，B基因组上的Wcor15基因在小麦的第一次异源多倍化的过程中就发生了变

5、异。3、以小麦全基因组数据库为基础，克隆了Wcor14位于小麦A、B、D基因组上的Wcor14-2A、Wcor14-2B和Wcor14-2D基因，并将其定位在小麦的第2部分同源染色体上。生物信息学分析发现该基因的5ʹ端上游调控区也含有Cor基因保守的CRT/DRE元件。在DNA水平，与Wcor14-2A和Wcor14-2D相比，IWcor14-2B基因在内含子区多出了一段序列，三种序列间在DNA水平相似性>83.6%，在氨基酸水平相似性:>97.9%。不同抗寒性品种中Wcor14-2A和Wcor14-2D序列无差异，而Wcor14-2B在品

6、种间存在15个多态性位点包括14个SNP和1个6bp的插入缺失。这15个多态性位点把Wcor14-2B分成了2种等位变异：Hap14a(缺失型)和Hap14b。比较Hap14a和Hap14b的氨基酸序列发现,发生在编码区的多态性位点引起了不同单倍型间氨基酸序列的差异,包括2个氨基酸的插入和三个氨基酸的替换。依据第一个外显子中6bp的InDel,开发了一对分子标记14AF/14AR。该标记与幼苗习性（冬春性）和苗期的抗寒性均显著相关，且基因型Hap14a是一种优异的等位变异。4、以水稻BC1和玉米Bk2序列为参考，结合小麦全基因组数据库，克隆

7、了小麦TaCOBL在A、B、D基因组上的基因TaCOBL-5A、TaCOBL-5B和TaCOBL-5D，并将其定位在小麦的第5部分同源染色体上。通过对小麦全基因组数据库的Blast，发现TaCOBL-5B在5BS上存在2个拷贝。TaCOBL-5A和TaCOBL-5D基因编码449个氨基酸，TaCOBL-5B编码450个氨基酸。聚类分析表明：小麦TaCOBL与水稻Bc1和玉米Bk2聚在一个分支上，它们氨基酸序列的同源性为84.6%，都含有COBRA蛋白家族保守的结构域，因此推断小麦的TaCOBL基因可能与水稻Bc1和玉米Bk2基因的功能相似，

8、与纤维素的合成有关。不同抗寒性品种中TaCOBL-5A和TaCOBL-5D序列无差异，而TaCOBL-5B在品种间存在一个4bp（TATA）的插入缺失。这个4bp的InDel把T