寡聚半乳糖醛酸对云南.ppt

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1、寡聚半乳糖醛酸对云南红豆杉细胞悬浮培养中紫杉醇及10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ生物合成的影响院系：药学院专业：生物制药作者：许栋华指导老师：王剑文副研究员背景简介紫杉醇(taxol)作为一种作用机制独特的植源性抗癌新药。但由于紫杉醇天然含量很低，加上资源本身亦非常贫乏，因此限制了紫杉醇的进一步开发和应用。为了解决其药源问题，科学家在寻找及扩大紫杉醇药源途径上（如筛选高产量红豆杉栽培品种、化学合成、生物技术及微生物中生产等）进行了艰苦的研究工作。近年来，细胞培养技术已成为对红豆杉属植物研究的重要手段。10-去乙酰基巴卡

2、亭Ⅲ（10-deacetylbaccatinⅢ，10-DABⅢ）是紫杉醇生物合成的重要前体物质，本身亦有抗癌活性。法国研究小组发现10-DABⅢ可从欧洲红豆杉的针叶中提取，其产率可达0.1%，10-DABⅢ的发现为通过连接紫杉醇侧链半合成紫杉醇提供了较佳方法。迄今已在数种红豆杉属植物中分离到该成分。它不仅来源广泛，而且提取的效率也较高，是一种较易检测及广阔开发前景的紫杉烷类物质。寡聚半乳糖醛酸（OGA）为果胶的不完全酶解产物，其单体半乳糖醛酸是组成植物细胞壁中果胶质的主要成分，参与细胞壁复杂网架的形成。以OG

3、A为诱导物，可诱导多种植物（如拟南芥、番茄、胡萝卜、马铃薯等）产生抗性反应，促进人参细胞中有效次生代谢产物人参皂苷的合成，本实验测定结果可见，OGA可显著提高云南红豆杉细胞中10-DABⅢ及紫杉醇的含量。第一部分云南红豆杉悬浮培养细胞生长周期内紫杉醇及10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量的变化第二部分寡聚半乳糖醛酸诱导云南红豆杉悬浮培养细胞最佳浓度的筛选第三部分寡聚半乳糖醛酸诱导云南红豆杉悬浮培养细胞最佳收获时间的筛选第一部分云南红豆杉悬浮培养细胞生长周期内Taxol及10-DABⅢ含量的变化1材料与方法1).云南红豆

4、杉细胞的培养研究用的细胞系是经多次继代培养的云南红豆杉（T.yunnanensis）细胞株。在改良的MS固体培养基上继代培养。将生长良好的细胞3g转入含30mLMS液体培养基的150mL三角瓶中，25℃，110r/min黑暗振荡培养。2).红豆杉细胞的处理本实验将云南红豆杉细胞悬浮培养，分别于接种后第0、1、4、7、10、13、16、19、22d收获细胞，提取紫杉醇及10-DABⅢ，HPLC法检测其含量，每种处理3个重复，共8组。3).紫杉醇及10-DABⅢ的含量分析色谱条件：10-DABⅢ含量测定：色谱柱（

5、RestekC18柱：150mm×2.1mm，5μm），流动相为甲醇-乙腈-水（2：3：8），检测波长为232nm，流速为0.2mL/min，柱温为35℃，进样量为10μL。Taxol含量测定：色谱柱（RestekC18柱：150mm×2.1mm，5μm），流动相为甲醇-乙腈-水（25：35：45），检测波长为227nm，流速为0.2mL/min，柱温为35℃，进样量为10ml。2结果与讨论第二部分寡聚半乳糖醛酸（OGA）诱导云南红豆杉悬浮培养细胞浓度的筛选1材料与方法1)．红豆杉细胞的培养（见第一部分1.1

6、.1）2)．OGA诱导子的制备多聚半乳糖醛酸经果胶酶室温下裂解20min，过滤，浓缩后冻干成粗OGA粉末。将OGA粉末配成1g/L溶液，经SephdexG-10柱处理滤除MW<700的寡聚物，所得溶液浓缩后用0.45μm微孔滤膜过滤除菌，作为OGA诱导子备用。3)．红豆杉细胞的诱导处理本实验将培养的云南红豆杉细胞分成对照组及处理组，处理组设4种不同诱导子浓度，分别为20、40、60、80μg/mL，对照组加入同量双蒸水。每种处理4瓶，共4个重复。细胞培养至第17天加入OGA，继续培养至第24天收获。4)．10

7、-DABⅢ及紫杉醇的含量分析（见第一部分1.1.3）2结果与讨论第三部分寡聚半乳糖醛酸（OGA）诱导云南红豆杉悬浮培养细胞最佳收获时间的筛选1材料与方法1).红豆杉细胞的培养（见第一部分1.1.1）2).OGA诱导子的制备（见第二部分1.1.2）3).红豆杉细胞的处理本实验将云南红豆杉细胞悬浮培养至第13d加入诱导子OGA（40mg/mL），25℃，110r/min黑暗振荡培养，分别于处理后第0、2、4、6、8d收获细胞，提取紫杉醇及10-DABⅢ，HPLC法检测其含量，每种处理3个重复，共5组。4).紫杉醇

8、及10-DABⅢ的含量分析（见第一部分1.1.3）2结果与讨论结论1采用HPLC（岛津）外标法可精确对紫杉醇及其前体10-DABⅢ定性，定量。2实验证实在细胞生长周期第10天时即对数生长期，细胞活力下降，是进行诱导处理的最佳时期。3实验证实当诱导子OGA的浓度为40mg/ml的时候，诱导的效果最佳。4实验证实悬浮细胞经诱导子OGA处理后，在第二天收获效果最佳。谢　谢！