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时间:2020-02-04
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1、血红蛋白的提取与分离高二生物科组袁妮2019年4月1.分离生物大分子的基本思路:选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2.蛋白质分离和提取的原理:根据蛋白质各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等,可以用来分离不同种类的蛋白质。基础知识3、提取分离方法凝胶色谱法凝胶电泳法基础知识2.凝胶:大多数凝胶是由多糖类化合物(如葡聚糖或琼脂糖)构成的多孔小球体,内部有许多贯穿的通道。根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小,利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,来进行分离。1.概念:(一)凝胶色谱
2、法(分配色谱法)基础知识(一)凝胶色谱法(分配色谱法)3.凝胶色谱法的原理①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢;②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。③依据的特性是:蛋白质分子量的大小。4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示(二)缓冲溶液1.概念:在一定的范围内,凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液P
3、H值的影响,维持PH基本不变。2.作用:基础知识(二)缓冲溶液基础知识3.缓冲溶液的配制:通常由1-2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。4.提问:在本课题中使用的缓冲液是:____,其目的是:利用缓冲液模拟细胞内的PH环境,保证血红蛋白的正常结构和功能,便于观察(红色)和科学研究(活性)磷酸缓冲液(三)电泳:1.概念:带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理:①许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解离的基团,在一定的PH下,这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反
4、的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小,形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。基础知识影响蛋白质分子运动速度的因素决定运动方向形成库仑力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√√√√3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图聚丙烯酰胺凝胶电泳1、测定蛋白质分子量:常用十二烷基硫酸钠(SDS)—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作
5、用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。2.原理:3.SDS作用机理:用SDS测定蛋白质分子量的方法使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时,可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳,根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置,可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。电泳检测结果琼脂糖凝胶电泳实验操作样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定1.样品处理:(一)蛋白质提取和分离步骤(二)操作过程可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。血液血浆水分固体物质:血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞
6、(最多)血红蛋白(90%)两个α-肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团2.提问:血液有哪些成分?1.提问:用鸡的红细胞提取DNA,用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么?鸡的红细胞具有细胞核,含有DNA,便于进行DNA的提取;人的红细胞无细胞核,结构简单,血红蛋白含量丰富,便于提取血红蛋白。血红蛋白两个α-肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团,此基团可携带一分子O2或一分子CO2,血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白的特点:(1)红细胞的洗涤:去除杂质蛋白,利于后续血红蛋白的分离纯化.1、采集血样2、低速短时间离心(速度越高和时间越
7、长,会使白细胞等一同沉淀,达不到分离的效果)3、吸取血浆:4、盐水洗涤:5、低速短时间离心:6、重复3、4、5步骤三次上清液中已没有黄色:红细胞洗涤干净。①目的:②操作:洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白。(2)血红蛋白的释放:加蒸馏水到原血液体积,加40%体积的甲苯(溶解细胞膜)置于磁力搅拌器搅拌10min(加速细胞破裂)红细胞破裂,释放出血红蛋白(3)分离血红蛋白溶液:①过程:将搅拌好混合液转移到离心管内,以2000r/min的速度离心10min。②试管中溶液层次:第1层(最上层):甲苯层(无色透明);第2层(中上层):脂溶性物质沉淀层(白色薄层固体);第3层(
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