课题3　血红蛋白的提取和分离.ppt

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1、蛋白质的分离和纯化一、蛋白质的分离2.根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。Q:下列蛋白质如何提取？酸性蛋白质；水溶性蛋白质；脂溶性蛋白质；偏碱性溶液透析液（中性缓冲液）有机溶剂原理1.根据细胞的结构特点，选择不同的破碎细胞的方法（如研磨法、超声波法、酶解法等），使各种蛋白质释放出来。一、蛋白质的分离1.抽提方法：（1）酸性蛋白质：（2）水溶性蛋白质：（3）脂溶性蛋白质：偏碱性溶液透析液（中性缓冲液）有机溶剂二、常用的分离方法1.离心沉降法2.薄膜透析法3.

2、凝胶色谱法4.电泳法1.离心沉降法原理：通过控制离心速率，使得分子大小、密度不同的物质发生分层沉降，从而分离出不同种类蛋白质。离心时相对分子质量大的物质先沉淀。2.薄膜透析法（1）原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将蛋白质与其他小分子化合物分离开。（2）方法：将待分离的蛋白质溶液装入用半透膜制成的透析袋内，再将透析袋放入透析液中便可进行透析。半透膜能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。小分子杂质（无机盐、单糖、二糖及氨基酸等）从透析袋中出来，而蛋白质留在袋内。3.蛋白质分离的方法：（1）透析法3.凝胶色谱法(1)凝胶：由多糖类化合物（如葡聚糖、琼

3、脂糖）构成的多孔球体，内含许多贯穿的通道(2)原理：大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。(3)作用：使样品中分子大小不同的蛋白质按顺序分离出来下图中最早洗脱下来的是什么？为什么？分子量大小直径大小大于凝胶颗粒空隙直径，被阻挡在颗粒的外面小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部运动方式垂直向下移动垂直向下移动，无规则扩散进入颗粒内部运动速度较快较慢运动路径较短较长洗脱次序先从凝胶柱洗脱出来后从凝胶柱洗脱出来用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快C．路程较

4、短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快D相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个B4.电泳(1)概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。方向：向着与其所带电荷相反的电极移动。(2)泳动速度和方向：速度：带电分子的迁移速度跟各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小,形状有关。一般来说，带电颗粒所带净电荷越多，直径越小，越接近于球形，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。电泳分离时，电荷量相差越大的物质相距越远。醋酸纤维薄膜电泳琼脂糖凝胶电泳SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳：测定蛋白质相对分子质量。SDS能使蛋白质完全变性，SDS所带电荷大

5、大超过了蛋白质原有电荷。迁移率取决于分子大小。(3)类型（载体）:使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异下列有关蛋白质提取和分离的说法，错误的是(　)A.透析法分离蛋白质的原理是利用蛋白质不能通过半透膜的特性B.采用透析法使蛋白质与其他小分子化合物分离开来C.离心沉降法通过控制离心速率使分子大小、密度不同的蛋白质分离D.蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相同的电极方向移动D三、血红蛋白的提取和分离1.样品处理2.粗分离3.纯化4.纯度鉴定1.样品处理（1）洗涤红细胞（低速短时离

6、心，生理盐水）目的：去除杂蛋白。血样先低速短时离心分离红细胞，然后吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。低速短时离心：防止速度过快、时间过长、白细胞沉淀。缓慢搅拌：防止红细胞破裂释放出血红蛋白。柠檬酸钠：防止血液凝固。（2）血红蛋白的释放在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。甲苯：溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。蒸馏水作用：使红细胞吸水胀破1、洗涤红细

7、胞的目的是A.去除血清B.去除杂蛋白C.除去血小板D.除去水B2、选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料，有何好处（）A.血红蛋白是有色蛋白B.红细胞无细胞核C.红细胞蛋白质含量高D.红细胞DNA含量高A3、为了提取血红蛋白，从学校附近的屠宰场取新鲜的猪血，对猪血处理的正确操作是()A.要在采血容器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠B.重复洗涤直到上清液呈红色为止C.将离心后的血细胞加入清水缓慢搅拌D.取血回来后，马上进行高速长时间离心A（3）分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合溶液中速长时离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的甲苯层，第二层为脂溶性物质的沉淀层，第

8、三层是血红蛋白的水溶液，第四层是其他杂质的暗红色沉淀