课题3　血红蛋白的提取和分离.ppt

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1、知识回顾1、凝胶色谱法:2、电泳：利用待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。是根据相对分子量的大小分离蛋白质的方法之一。课题3血红蛋白的提前和分离阅读课本相关内容，思考以下问题：1、蛋白质的提取和分离一般分成几步？2、样品怎样处理？3、蛋白质的粗分离？4、各步骤的目的和方法？二、实验操作样品处理（一）蛋白质提取和分离步骤红细胞的洗涤粗分离：血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液纯化：纯度鉴定透析凝胶色谱法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电

2、泳1.样品处理：---取材（二）操作过程可选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的新鲜血液来分离血红蛋白。注意：为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂柠檬酸钠。思考1.血液有哪些成分？思考2：血红蛋白有什么特点？思考3：用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？血液血浆水分其他物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）思考1.血液有哪些成分？血红蛋白两条α－肽链两条β一肽链四个亚铁红素基团亚铁血红素基团答：每条肽链环绕一个亚铁血红素基团

3、，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈红色思考2：血红蛋白有什么特点？思考3：用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊等哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？答：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；猪、牛、羊等哺乳动物的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。(1)红细胞的洗涤:去除杂质蛋白，利于后续血红蛋白的分离纯化.①目的:实验操作（一）样品处理②方法：实验操作（一）样品处理a、采集血样：b、低速短时间离心：（500r/min离心2mi

4、n）c、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。d、盐水洗涤：下层暗红色的红细胞+五倍体积的0.9％的NaCl溶液洗涤，搅拌10mine、低速短时间离心：f、重复以上三步步骤三次上清液中已没有黄色：红细胞洗涤干净。②方法：初次离心后的结果3次洗涤后的结果思考1、洗涤操作过程中，为什么要低速短时间离心？且洗涤次数不能过少？答：速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果。洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白。思考2、用质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤，能否用蒸馏水代替？为什么？答：不能，0.9％的氯化钠

5、溶液能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，若用蒸馏水红细胞提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大分离难度。(2)血红蛋白的释放：①目的：②方法：红细胞破裂，释放出血红蛋白洗涤好的红细胞加蒸馏水到原血液体积加40％体积的甲苯置于磁力搅拌器搅拌10min红细胞破裂，释放出血红蛋白（使红细胞大量吸水胀裂）(溶解红细胞的细胞膜)(加速红细胞的破裂)②方法：(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min。混合液分层，过滤除去杂志得血红蛋白。将血红蛋白和其他杂质分离

6、开，便于下一步对血红蛋白的纯化。②方法：①目的：有机溶剂无色透明的甲苯层脂类物质白色脂溶性物质沉淀层血红蛋白溶液红色透明液体层红细胞破碎物沉淀暗红色杂志沉淀层③试管中溶液层次（4层）④血红蛋白的分离：滤纸过滤除去脂类、红细胞破碎物沉淀层烧杯分液漏斗分出下层的红色透明液体血红蛋白静置片刻转移除去样品中分子量较小的杂质和离子。或用于更换样品的缓冲液。2.粗分离----透析(1)目的：（2）透析的原理：(3)方法：（2）透析的原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内说明：透析袋一般用硝酸纤维素(又称玻

7、璃纸)制成，是一种半透膜.取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液的烧杯中（pH为7.0），透析12h20mmol/L磷酸缓冲液1mL(3)方法：透析过程动画演示小结：1、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。2、血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放3、分离血红蛋白溶液：离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。4、粗分离----透析：将红色透

8、明液体装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。